白細胞介素-1β對大鼠軟骨細胞MMP-13表達的影響及miR-27b的調控作用

王欣，秦宇

白細胞介素-1β對大鼠軟骨細胞MMP-13表達的影響及miR-27b的調控作用

王欣1，2，秦宇1

目的觀察白細胞介素（IL）-1β對大鼠軟骨細胞基質金屬蛋白酶（MMP）-13表達的影響及miR-27b的調控作用。方法雄性Wistar大鼠7只提取軟骨細胞。Western blot檢測IL-1β刺激軟骨細胞0 h、24 h、48 h各時間點MMP-13表達變化；miRNAs微陣列分析48 h內軟骨細胞差異表達的miRNAs；Real-time PCR定量分析篩選出下調最為明顯的miRNAs；熒光素酶報告基因實驗驗證miR-27b與MMP-13的靶定調控關系。結果IL-1β刺激軟骨細胞后，MMP-13蛋白在0 h、24 h、48 h各時間點表達逐漸增加（P＜0.05）；miRNAs微陣列分析發現48 h內軟骨細胞有36個miRNAs出現表達變化，變化最為明顯的有6個，分別為miR-27b、miR-31、miR-26a、miR-26b、miR-23、miR-204；Real-time PCR顯示miR-27b下調最為明顯；miR-27b擬似物和熒光素酶表達質粒共轉染軟骨細胞后，熒光素酶活性受到明顯抑制（P＜0.05）。結論IL-1β刺激軟骨細胞后，出現miR-27b的表達下調和MMP-13蛋白的表達上調，miR-27b與MMP-13存在靶定調控關系。

軟骨細胞；基質金屬蛋白酶13；微RNAs；白細胞介素1β；微陣列分析；微小RNA-27b

骨性關節炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性關節疾病，主要表現為負重關節軟骨局限性、進行性破壞及關節邊緣骨贅形成，并伴有不同程度的滑膜炎癥。臨床上可產生關節疼痛、活動受限和關節畸形等癥狀。OA的發病可能與細胞因子、自由基、肥胖、雌激素缺乏等因素有關，但確切病因尚未完全闡明［1-2］。軟骨細胞位于細胞外基質中，后者是軟骨的主要功能載體，由Ⅱ型膠原蛋白和軟骨中特有的蛋白多糖構成［3］。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）被認為在軟骨細胞外基質的破壞和重建中發揮重要作用，其中MMP-13具有廣泛的酶活性，對Ⅱ型膠原具有最為活躍的降解能力［4］。白細胞介素（IL）-1β是一種有效的MMP誘導劑，在軟骨的降解、退變過程中起重要作用［5］。目前關于IL-1β對MMP-13的調控作用及調控機制的研究鮮有報道。近年發現微小RNA（microRNAs，miRNAs）通過與靶基因3′端非編碼區（3′Untranslated Region，3′UTR）結合，在蛋白質翻譯水平上抑制靶mRNA表達或誘導mRNA降解，被認為是轉錄后基因調控的關鍵因素［6］。有證據表明，miRNAs表達改變參與了OA過程中軟骨細胞損傷［7］。本研究擬以大鼠軟骨細胞為研究對象，探討IL-1β的刺激下，miRNAs差異表達與MMP-13之間的關系，為OA早期防治提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物選取體質量180～220 g的雄性Wistar大鼠（SPF級，由天津醫科大學實驗動物中心提供）。實驗室溫度20～25℃，濕度50%～60%，自由飲水。

1.1.2 儀器與試劑倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Ther?mo Scientific CO2培養箱（美國Thermo公司）；LightCycler 96實時熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）；凝膠成像儀（美國SynGene公司）；電子天平（上海精密儀器科技有限公司）；臺式離心機（北京東迅天地醫療儀器有限公司）；DMEM胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；Lipofectamine 2000、NCode?VILO?miRNA cDNA合成試劑盒（美國Invitrogen公司）；mirvana?miRNA分離試劑盒、TaqMan MicroRNA Array v2.0（美國Applied Biosystems公司）；MMP-13兔抗大鼠單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；miR-27b擬似物、miR-27b拮抗劑、陰性對照（上海吉瑪制藥技術公司）；雙熒光素酶報告基因實驗系統（美國Promega公司）

1.2 方法

1.2.1 大鼠原代軟骨細胞的分離、培養及分組參考文獻［8］，將雄性Wistar大鼠7只，以10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，超凈平臺中無菌條件下切去髖關節、膝關節、肩關節軟骨，切成1～2 mm3碎塊，以0.25%胰蛋白酶消化，再加入0.2%Ⅱ型膠原酶10 mL，于37℃細胞培養箱中消化4～5 h，濾去軟骨組織，濾液以3 000 r/min離心5 min，加入含10%胎牛血清DMEM培養液，置于培養箱中培養。細胞貼壁融合率達85%～90%時，即用胰蛋白酶消化并進行傳代，第3代軟骨細胞按1×106/孔接種于6孔板。每3孔作為一組，分為對照組和IL-1β刺激組。對照組不予刺激。IL-1β刺激組用含有10 μg/L無血清培養基培養大鼠軟骨細胞，于第24 h和48 h以倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，同時收集細胞并提取RNA。

1.2.2 細胞核形的觀察培養的軟骨細胞置于玻片上，以PBS洗滌3遍，后滴加幾滴DAPI（4′，6-diamidino-2-phenyl?indole）染液，染色10 min。流水沖去染液，濾紙吸除多余水分，加1滴熒光封片液，置于熒光顯微鏡下觀察，激發波長360～400 nm。

1.2.3 miRNA微陣列分析軟骨細胞總RNA以mirvana?miRNA分離試劑盒提取，分離方法參照說明書進行?？俁NA的濃度和純度用分光光度計評估。提取5 μg RNA進行微陣列分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測逆轉錄反應依照NCode? VILO?miRNA cDNA合成試劑盒的方法合成cDNA，根據GenBank的基因序列為miR-27b、miR-31、miR-26a、miR-26b、miR-23、miR-204設計引物，取U6作為內參。PCR反應程序為：95℃預變性5 min，95℃變性15 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，共40個循環，最后72℃延伸40 min。結果用Applied Biosystems SDS軟件包（2.2版）分析，每組實驗重復3次。

1.2.5 熒光素酶報告基因實驗驗證靶基因首先應用生物信息學軟件Targetscan（http：//www.targetscan.org）和PicTar（http：//pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/new_PicTar_vertebrate.cgi？species=vertebrate）分析miR-27b可能的靶基因。再以基因組DNA為模板擴增MMP-13的3′-UTR，在引物中引入PmeⅠ和XbaⅠ的酶切點和保護堿基。引物序列為：上游5′-GA?CAGCAUAGGCGAUAAGAGCGCCGAAAG-3′；下游5′-GCG?GAAGACCCGACGGACCCGGAGGCCCG-3′，測序正確后克隆到pmirGLO熒光素酶質粒，獲得pGLO-MMP13-3′-UTR重組質粒。體外合成含上述位點突變體的DNA片段，測序正確后克隆到pmirGLO熒光素酶質粒，突變質粒命名為pG?LO-MMP13-3′-UTR-mut。將細胞接種于24孔板中，按照Lipofectamine 2000說明書進行瞬時轉染。分別轉染pGLOMMP13-3′-UTR序列、pGLO-MMP13-3′-UTR-mut序列、miR-27b擬似物序列、miR-27b拮抗劑序列和對照序列。培養24 h后，用熒光素酶檢測試劑盒測定螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性的比值代表細胞熒光素酶的表達水平。轉染效率通過Real-time PCR和Western blot法檢測。

1.2.6 Western blot檢測MMP-13蛋白的表達放射免疫沉淀實驗（RIPA）裂解液裂解細胞，離心后取上清液提取總蛋白。每條泳道以40 μg蛋白量上樣，7.5%SDS-PAGE分離蛋白質，濕法轉移將蛋白電轉到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入制定的MMP-13一抗，4℃過夜，洗膜，后用HRP標記的二抗常規孵育1 h，增強化學發光（ECL）試劑反應1 min，曝光成像。以β-actin作為內參。

1.3 統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，實驗結果用均數±標準差表示，多組均數比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-1β誘導軟骨細胞形態學以及細胞核的改變接種后，光學顯微鏡下可見懸浮于培養液中的軟骨細胞為小圓形，靜置24 h后，大多數細胞開始貼壁、增殖，并逐漸融合形成單層，呈不規則立體“鋪路石”樣。DAPI染色后見細胞核熒光著色均勻，胞核結構正常。IL-1β處理24 h后，部分細胞由圓形或橢圓形逐漸變成長梭形，細胞膜完整性被破壞。DAPI染色后，部分胞核因染色質聚集而呈現出核區致密濃染，核區熒光發白發亮。IL-1β處理48 h后，上述形態變化更加明顯，見圖1。

Fig.1Observation of chondrocyte morphology induced by IL-1β（×400）圖1 IL-1β誘導軟骨細胞形態學觀察（×400）

2.2 IL-1β誘導軟骨細胞MMP-13表達變化IL-1β處理軟骨細胞48 h內MMP-13表達逐漸增加（F=20.453，P＜0.05）。其中，24 h時MMP-13蛋白表達較0 h明顯增加（0.47±0.04 vs 0.21±0.02，P＜0.05），處理48 h后MMP-13蛋白表達（0.77±0.06）較24 h增加更為明顯（P＜0.05），見圖2。

Fig.2Changes in MMP-13 expression in rat chondrocytes upon IL-1β stimulation圖2 IL-1β處理后軟骨細胞MMP-13蛋白表達變化

Fig.3miRNA microarray of rat chondrocytes 48 h after IL-1β stimulation圖3 IL-1β處理軟骨細胞48 h后miRNAs微陣列芯片的差異表達分析

Tab.1Expression of 6 most obviously changed miRNAs in rat chondrocytes upon IL-1β stimulation for 48 h表1 IL-1β處理軟骨細胞48 h，改變最為明顯的6個miRNAs表達情況（n=3，）

Tab.1Expression of 6 most obviously changed miRNAs in rat chondrocytes upon IL-1β stimulation for 48 h表1 IL-1β處理軟骨細胞48 h，改變最為明顯的6個miRNAs表達情況（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與0 h比較，b與24 h比較，P＜0.05

時間0 h 2 4 h 4 8 h F m i R -2 7 b 1 ± 0 0 . 4 7 7 ± 0 . 2 6 3 a 0 . 1 6 7 ± 0 . 0 1 5 a b 2 3 . 0 5 1＊＊m i R -3 1 1 ± 0 0 . 6 8 3 ± 0 . 0 6 1 a 0 . 3 4 7 ± 0 . 1 9 7 a b 2 2 . 5 1 6＊＊m i R -2 6 a 1 ± 0 1 . 5 5 7 ± 0 . 2 0 5 a 2 . 6 1 3 ± 0 . 2 9 3 a b 4 7 . 3 0 4＊＊時間0 h 2 4 h 4 8 h F m i R -2 0 4 1 ± 0 2 . 7 7 7 ± 0 . 2 7 2 a 3 . 6 1 3 ± 0 . 4 9 9 a b 4 9 . 6 0 0＊＊m i R -2 6 b 1 ± 0 1 . 6 4 0 ± 0 . 2 2 3 a 2 . 6 6 3 ± 0 . 2 8 4 a b 4 8 . 6 0 8＊＊m i R -2 3 1 ± 0 2 . 6 0 7 ± 0 . 4 0 1 a 3 . 4 7 0 ± 0 . 4 3 9 a b 4 0 . 0 6 8＊＊

2.3 IL-1β誘導軟骨細胞miRNAs差異表達變化及結果驗證miRNA微陣列分析顯示，IL-1β處理軟骨細胞的24 h及48 h后，有36個miRNAs表達水平發生改變。在表達減少的miRNAs中，miR-27b、miR-31下調最為明顯；表達增加的miRNAs中，miR-26a、miR-26b、miR-23、miR-204上調最為明顯，見圖3。與miRNAs微陣列分析結果一致，miR-27b和miR-31在IL-1β處理24 h及48 h表達逐漸下調。miR-26a、miR-26b、miR-23、miR-204在24 h及48 h表達逐漸上調，見表1。miRNAs微陣列分析及Realtime PCR均表明，IL-1β處理軟骨細胞48 h后，miR-27b下調最為明顯。

2.4 miR-27b靶定調控MMP-13Targetscan和Pic? Tar分析發現，miR-27b在基因MMP-13 3′-UTR預測到作用靶點，見圖4a。軟骨細胞轉染miR-27b擬似物后MMP-13蛋白表達下調（P＜0.05），見圖4b。miR-27b擬似物和熒光素酶表達質粒共轉染軟骨細胞后，熒光素酶活性受到明顯抑制；miR-27b擬似物與pGLO-MMP13-3′-UTR-mut共轉染后，熒光素酶活性較對照組無明顯變化，見圖4c。軟骨細胞轉染miR-27b拮抗劑抑制內源性miR-27b表達后，熒光素酶活性與對照組比較差異無統計學意義，見圖4d。

Fig.4miR-27b and MMP-13 present targeted regulation relationship圖4 miR-27b靶定調控MMP-13

3 討論

3.1 miR-27b對OA發展的調控作用本研究顯示，正常軟骨細胞不表達或表達極微量的MMP-13蛋白，IL-1β處理軟骨細胞48 h過程中，MMP-13蛋白表達逐漸增加，miR-27b表達明顯下降，經熒光素酶報告基因實驗驗證miR-27b可以靶定調控軟骨細胞MMP13表達，說明miR-27b可能在OA發展過程中起到調控樞紐作用。

3.2 IL-1β、MMP-13與OA過程中軟骨破壞密切相關MMPs是一大類具有相似結構的蛋白酶，構成了細胞外基質降解最重要的蛋白水解系統，在組織重建和修復中起重要作用。MMP-13是與OA密切相關的一種膠原酶，主要分解關節原有的Ⅱ型膠原，后者是膠原的主要組成部分，占膠原總量的80%～95%，在關節承受力方面必不可少［9］。Ⅱ型膠原的不斷分解可造成軟骨慢性進行性破壞，給關節帶來不可逆損傷。有研究表明，IL-1β是一種有效的MMP誘導劑，有促進軟骨細胞代謝和降解細胞外基質的作用，用抗體中和IL-1β后可以阻止軟骨和骨的破壞［10］。IL-1β在OA患者關節液中大量存在，被認為是OA中起關鍵作用的促炎癥性細胞因子［11］。MMP過表達或長時間表達將導致OA的發生，產生MMP的細胞必須采用多重機制保持對MMP的調控［12］。本研究表明，IL-1β刺激大鼠軟骨細胞后MMP-13蛋白表達明顯增加且呈時間依賴性，IL-1β可能通過轉錄后調控機制參與了MMP-13蛋白的上調。

3.3 miR-27b靶定調控MMP-13miRNAs是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，通過調控靶基因表達影響細胞生物學行為。單個miRNA分子可以調控數十到數百個基因，內源性miRNA雖然只占人類基因總數的2%，卻調控著人類全基因組中30%以上的基因，其作為基因表達和蛋白質翻譯過程中的調節分子［13］，miRNAs的差異表達可能與OA有關［14］。本研究表明，IL-1β處理軟骨細胞的24 h及48 h后，miR-27b下調最為明顯。生物信息學分析表明，miR-27b在MMP-13 mRNA 3′-UTR存在潛在作用的靶點。熒光素酶報告基因實驗驗證MMP-13為miR-27b作用的靶基因。大鼠19號染色體存在2個miR-27基因（Mir27a和Mir27b），成熟的miR-27a和miR-27b在3′-UTR只有1個不同的核苷酸序列。而本研究中大鼠軟骨細胞miR-27a的差異表達并未被檢測到，由此可以認為與miR-27a不同，miR-27b為IL-1β的應答基因。在IL-1β的刺激下，軟骨細胞miR-27b表達明顯減少，不能有效靶定下調MMP-13蛋白的表達，從而造成軟骨細胞MMP-13的明顯上調。

3.4 核因子（NF）-κB可能參與了miR-27b對MMP-13的調控NF-κB屬于核轉錄因子成員，能與多種基因的啟動子或增強子上的NF-κB結合位點發生特異性結合啟動基因轉錄。目前的研究顯示NF-κB參與對miRNA的表達調控［15］。IL-1β介導的MMP-13蛋白表達需要NF-κB的激活［16］，且軟骨細胞中NF-κB激活對miR-27b的表達起負性調控作用［17］。本研究顯示，IL-1β處理軟骨細胞后miR-27b表達明顯減少，伴隨MMP-13蛋白表達增加，可能與NF-κB的激活有關。

綜上所述，IL-1β刺激的軟骨細胞miR-27b表達明顯下調，對MMP-13靶定調控作用減弱，造成軟骨細胞損傷，此過程可能參與了OA的發生、發展。本研究從miRNAs的角度為軟骨細胞損傷機制提供了證據，為OA防治提供了新的靶點。

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（2015-01-08收稿2015-03-06修回）

（本文編輯李鵬）

Effects of interleukin-1β on MMP-13 expression in rat chondrocytes and its regulation of miR-27b

WANG Xin1，2，QIN Yu1
1 Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Orthopedics，Tianjin Harbor Hospital

ObjectiveTo observe the effect of interleukin-1β（IL-1β）on expression of Matrix Metalloproteinases 13（MMP-13）in rat chondrocytes and its regulation of miR-27b.MethodsChondrocytes were extracted from 7 Wistar male rats.Expression of MMP-13 were examined by Western blot at 0 h，24 h，48 h after IL-1β stimulation.Differential miRNAs expression profiles were examined by miRNAs microarray.The most obviously down-regulated miRNAs were confirmed by quantitative Real-time PCR.Targeted regulation relationship between miR-27b and MMP-13 was set up by Luciferase re?porter gene experiments.ResultsExpression of MMP-13 in rat chondrocytes was increased at a timely dependent manner upon IL-1β stimulation（P＜0.05）；Microarray revealed 36 miRNAs whose expression changed，among which 6（miR-27b，miR-31，miR-26a，miR-26b，miR-23，miR-204）were especially obvious.Real-time PCR confirmed that miR-27b was the one whose expression level were most down-regulated.Transient co-transfection of miR-27b mimics with luciferase expres?sion plasmids resulted in significant repression of luciferase activity in rat chondrocytes（P＜0.05）.ConclusionIL-1β stimulation result in down-regulation of miR-27b and up-regulation of MMP-13 expression.MiR-27b and MMP-13 show targeted regulation relationship.

chondrocytes；matrix metalloproteinase 13；microRNAs；interleukin-1beta；microarray analysis；miR-27b

R349.5

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.011

1天津醫科大學（郵編300070）；2天津港口醫院骨科

王欣（1979），男，大學本科，主治醫師，主要從事骨科創傷研究