AMPA受體參與大鼠胸髓前角發育早期突觸傳遞的生理學特點①

張雯秀，段紅梅，謝雅彬，李曼麗，楊朝陽，李曉光

·基礎研究·

AMPA受體參與大鼠胸髓前角發育早期突觸傳遞的生理學特點①

張雯秀1，段紅梅2，謝雅彬1，李曼麗2，楊朝陽1，李曉光1

目的探討α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體參與大鼠脊髓發育早期突觸傳遞的生理學特點。方法選取胎齡17 d(E17,n=12)和20 d(E20,n=12)的Wistar大鼠以及新生7 d(P7,n=12)的Wistar大鼠共計36只。胸髓鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)免疫熒光染色觀察AMPA受體的分布，電生理平面微電極陣列記錄技術(MED-64系統)檢測AMPA受體參與突觸傳遞的場興奮性突觸后電位(fEPSP)的變化。結果E17大鼠脊髓灰質開始出現少量CaMKⅡ陽性神經元，E20、P7大鼠脊髓周圍CaMKⅡ陽性神經元逐漸向內遷移，神經元的數量不斷增多。電生理結果顯示，E17、E20、P7大鼠誘發的fEPSP數量依次增多，并能夠被6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)阻斷，脊髓灰質內突觸聯系的空間網絡范圍顯著減小(P＜0.001)。結論AMPA受體參與大鼠脊髓早期發育，并作為脊髓前角神經網絡中功能性突觸聯系的主要興奮型受體。

α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體；脊髓發育；場興奮性突觸后電位；突觸聯系；大鼠

[本文著錄格式] 張雯秀，段紅梅，謝雅彬，等.AMPA受體參與大鼠胸髓前角發育早期突觸傳遞的生理學特點[J].中國康復理論與實踐,2015,21(12):1385-1390.

CITED AS:ZhangWX,Duan HM,Xie YB,etal.Physiological characteristics of synaptic transm ission of anteriorhorn early development in thoracic spinal cordmediated by AMPA receptors in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(12):1385-1390.

脊髓在發育過程中，中央管的室管膜細胞逐漸增殖、遷移，并分化形成不同類型的神經元。神經元按照釋放遞質的不同分為膽堿能神經元、氨基酸能神經元、肽能神經元及胺能神經元。α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(α-am ino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid,AMPA)受體是中樞神經系統主要的興奮性突觸后谷氨酸能神經元受體，與N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體同屬離子型谷氨酸受體家族，由4個亞基(GluA1～GluA4)組成，具有功能性配體門控離子型通道[1-3]。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組

Wistar健康雌性大鼠18只，SPF級，體質量220～250 g；雄性大鼠9只，體質量300～350 g。均由首都醫科大學動物實驗中心提供。

在動物部(溫度24～26℃，濕度50%)飼養1周后，按照雌∶雄=2∶1的比例進行合籠，動物自由取食、飲水，于合籠第2天開始觀察，若觀察到有陰栓視為懷孕(E0)，將懷孕后的雌鼠單籠飼養并標記分組，仔鼠出生當日視為P0。依次分為E17組(n=12)、E20組(n= 12)、P7組(n=12)。

1.1.2主要試劑和儀器

小鼠抗微管相關蛋白2(m icrotubule associated protein 2,MAP2)單克隆抗體、兔抗CaMKⅡ多克隆抗體、6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione,CNQX)：SIGMA公司。A lexa 594山羊抗兔和Alexa 488山羊抗小鼠熒光二抗：INVITROGEN公司。Hoechst33342：SIGMA公司。

P515A探針MED64 Probe：日本ALPHA MED SCIENTIFIC。SHA-22L蓋網及錨：HARVARD， USA。CM 1850恒冷切片機：德國LEICA。DTK-1000振動切片機：日本DSK。DP73 CCD顯微照相機：OLYMPUS。BX51熒光顯微鏡：OLYMPUS。

1.2方法

1.2.1灌流切片

孕鼠6%水合氯醛0.6m l/100 g腹腔麻醉，0.9%氯化鈉300m l快速心臟灌注10m in后再慢速灌注約30 m in，換4%多聚甲醛500m l心臟慢速灌注約40m in，剖腹取出E17、E20胎鼠，并將脊髓完整取出，置于4%多聚甲醛(pH 7.2)中固定8 d后換30%蔗糖脫水，直到脊髓完全沉底；P7仔鼠同樣用6%水合氯醛腹腔麻醉，經心臟灌注后取出脊髓，固定過夜換30%蔗糖脫水直至完全沉底，取胸髓節段。-25℃恒冷切片機連續冠狀切片，厚20μm，貼片并于-20℃冰箱保存。

1.2.2免疫熒光染色

切片從-20℃冰箱取出晾干并復溫至室溫。分別用蒸餾水及PBST各漂洗5m in，3次，用10%正常山羊血清NGS室溫封閉30m in，加入小鼠抗MAP2和兔抗CaMKⅡ一抗混合液(均為1∶200)，4℃冰箱孵育60 h。PBST漂洗5m in，3次，加入A lexa 594標記山羊抗兔和A lexa 488標記山羊抗小鼠熒光二抗混合液(均為1∶100)，室溫孵育8 h。PBST漂洗5 m in，3次，Hoechst33342(1∶2000)復染核，室溫5 min，PBST漂洗5m in，蒸餾水漂洗5m in，2次，防淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡鏡檢并拍照保存。

1.2.3電生理記錄

1.2.3.1脊髓薄片制備

孕鼠用6%水合氯醛0.6m l/100 g腹腔麻醉，分別取出胎鼠。出生后大鼠用6%水合氯醛0.6m l/100 g腹腔麻醉。依次分離皮膚、肌肉及椎板并將脊髓完全暴露，將完全剝離的脊髓置于冰水混合的人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)中靜置30 s后，光學顯微鏡下分離出胸段脊髓并剝去硬脊膜。將修整好的脊髓固定在振動切片機浴槽的底板上，切取厚350～400μm的冠狀胸段脊髓片，將脊髓片置于通有95% O2和5%CO2混合氣的孵育液中，孵育1.5～2 h。

1.2.3.2MED-64平面微電極陣列記錄

探針MED64 Probe使用前用0.1%聚氮丙啶(polyethylenim ine,PEI)硫化物硼酸鹽過夜處理，并在實驗前用蒸餾水反復沖洗5次。脊髓經過1.5～2 h孵育后，選取一張結構清晰完整的脊髓片移入到MED64 Probe中，在倒置顯微鏡(Olympus,SZ51)下找到脊髓前角區域，調整位置直到64個電極點全部覆蓋在脊髓前角區域，用蓋網及錨固定脊髓片，使用蠕動泵(M inipuls3,Gilson)持續灌流通有混合氣(95%O2和5%CO2)的ACSF，流速為2～5m l/m in。持續灌流20m in并檢測灌流噪聲，待灌流噪聲穩定在±5μV時開始記錄。刺激強度依次從30～199μA進行選取，選擇能夠引起40%～60%最大反應強度的電流強度進行記錄，刺激頻率為0.1 Hz。開始記錄20m in后以AMPA受體阻斷劑6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione,CNQX)10μmol/L灌流，待興奮性突觸后電位(excitatory postsynaptic potential,EPSP)振幅明顯下降后進行洗脫。用CCD顯微照相機采集脊髓片MED-64 Probe圖像。

1.3統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potentials,fEPSP)數量根據MED-64通道中能夠記錄到fEPSP的通道數量計算。fEPSP振幅選取10ms為時間窗，以基線0 μV為起始到fEPSP波谷的距離記為反應振幅。電生理統計的下降率按(基線－給藥)/基線×100%計算。所有計量資料采用(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析，顯著性水平α=0.05。

2　結果

2.1免疫熒光染色

E17大鼠MAP2與CaMKⅡ雙陽性細胞數較少，神經元呈圓形或橢圓形，沒有明顯的樹突及軸突形態(圖1A、圖1a)。E20和P7大鼠脊髓灰質內陽性細胞數明顯增多，灰質所占比例減小，神經元形態逐漸發育完善，形成具有樹突及軸突的多角形神經元(圖1B、圖1b和圖1C、圖1c)。

圖1　三組大鼠脊髓前角MAP2(綠)與CaMKⅡ(紅)免疫熒光染色

2.2fEPSP

E17、E20和P7大鼠給予最佳刺激，在刺激點周圍可以觀察到兩種波形不同的電位反應(圖2)。fEPSP數量統計結果顯示，從E17到P7，誘發的fEPSP數量逐漸增多(P＜0.001)。見圖3。fEPSP振幅顯著減小(P＜ 0.001)。見圖4。

CNQX灌流脊髓切片后，可以觀察到fEPSP的振幅顯著降低，洗脫后基本恢復。見圖5。

對比給藥前，三組給藥后fEPSP的振幅分別顯著減小(68.04±3.34)%、(88.72±2.90)%、(81.93±3.86)% (P＜0.001)。見圖6。

圖2　MED-64系統記錄大鼠脊髓前角fEPSP放電分布情況

圖3　三組大鼠脊髓前角fEPSP放電數量(n=6)

圖4　三組大鼠脊髓前角fEPSP振幅變化(n=6)

圖5　應用AMPA受體競爭性拮抗劑CNQX阻斷大鼠脊髓前角fEPSP振幅變化情況(CCD顯微照相機攝)

圖6　應用AMPA受體競爭性拮抗劑CNQX阻斷大鼠脊髓前角fEPSP振幅變化情況

3　討論

CNS損傷一直被認為是中樞神經修復的一個重大難題，其中研究CNS發育是現代神經科學領域了解CNS再生后神經元變化的主要方式。AMPA受體作為哺乳動物CNS中重要的興奮性谷氨酸非NMDA離子型受體，介導CNS中快興奮性突觸傳遞，主要參與CNS神經發育和信號轉導。近期研究發現，AMPA受體主要分布在大腦海馬[9]及小腦[10-11]的一些腦區神經細胞的突觸后膜上，并參與學習和記憶活動[12]。但是對于AMPA受體在脊髓中的作用及功能卻鮮有報道。

MED-64通道系統作為近年來研究神經網絡的一種新型技術，已經被作為研究各突觸間神經網絡關系的一種重要手段[13-15]，它可以選擇一個點作為刺激位點并觀察和持續記錄周圍63個位點的電位變化，并可以通過藥理學手段來觀察其藥理學變化。

在哺乳動物胚胎發育階段，中央管中的神經上皮細胞逐漸發育形成室管膜細胞，在脊髓發育神經板時期，腹側的底板細胞發育形成脊髓灰質前角，運動神經元主要分布于此[16]。樹突是神經元中接收、整合及傳遞信息的重要因素，樹突的發育情況直接影響神經電活動情況以及神經網絡的形成[17]。

本研究結果顯示，E17胎鼠胸段脊髓前角的MAP2陽性細胞較少。隨著發育的進行，神經元逐漸向中央遷移，前角中MAP2陽性細胞數量明顯增多。神經元逐漸由橢圓形變成多角形，神經絲結構逐漸清晰，樹突結構明顯，脊髓灰質逐漸呈現 “蝴蝶”型。說明胚胎期脊髓灰質中的祖細胞經過分化和遷移，逐漸形成成熟的神經元。

谷氨酸是CNS中主要的興奮性神經遞質，CaMKⅡ磷酸化谷氨酸AMPA受體，增加其電導性[18]，并且在大腦中能夠誘導激活AMPA受體的轉運和學習功能[19]。在本實驗中，MAP2與CaMKⅡ陽性細胞E17即共定位表達，說明從E17開始，脊髓前角的成熟神經元中已經存在AMPA受體。

近年來研究發現，神經系統的發育可以分為兩個時期：①機體自身驅動的活動，由此建立一個網絡框架；②活動依賴性的可塑性，在已經建立的突觸上加工和修飾[20]。在哺乳動物胚胎發育階段和出生后早期，自發突觸活動主要驅動其所需的循環機制；隨后根據機體內環境的變化，誘發出一系列的突觸活動，并在神經系統發育成熟中起重要作用[20]。

fEPSP是由刺激脊髓前角神經元并在周圍神經元內記錄到的電活動，當分別給予E17、E20、P7大鼠胸段脊髓前角相同刺激強度時，記錄電極所記錄到的fEPSP數量隨著發育的進行而增多，并且形成不同類型的放電波形，包括正向波和負向波；隨著發育的進行，fEPSP的振幅逐漸減小。以上結果說明大鼠脊髓在發育過程中由于神經元逐漸發育完善，突觸間的聯系增多，并逐漸形成功能性神經網絡。這與免疫熒光染色結果相一致。

有研究表明，AMPA受體過量表達會引起肌萎縮側索硬化癥、腦卒中和脊髓損傷[21-22]。而同樣有研究表明，CNQX作為AMPA受體拮抗劑能夠抑制AMPA受體介導的電活動，可以作為神經保護劑治療神經退行性疾病和外傷[23]。另外，在大腦[24]與小腦[25]中，CNQX通過抑制中間神經元的興奮性反應，使細胞間突觸傳遞減少，進一步提高下一級神經元的興奮性。本實驗顯示，CNQX可以抑制AMPA受體介導的負向fEPSP振幅，采用ACSF進行灌流洗脫后fEPSP恢復。這說明在大鼠胸髓前角發育早期存在AMPA受體，并作為興奮性功能突觸受體傳遞神經電活動，這也與發育期AMPA受體的變化規律相吻合。

綜上所述，AMPA受體可能作為脊髓發育早期主要的興奮性功能突觸發揮信號傳導作用，在早期神經網絡活動中起重要的調控作用。谷氨酸能AMPA受體如何在參與脊髓發育早期突觸傳遞的過程中受到多種其他受體的影響，如何調控與其他受體間的相互作用，將可能成為研究AMPA受體突觸傳遞調節機制新的熱點。

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Physiological Characteristics of Synap tic Transm ission of Anterior Horn Early Developm ent in Thoracic Spinal Cord Mediated by AMPAReceptors in Rats

ZHANGWen-xiu1,DUANHong-mei2,XIEYa-bin1,LIMan-li2,YANG Zhao-yang1,LIXiao-guang1
1.Department of Neurobiology,CapitalMedical University,Beijing 100069,China;2.Departmentof Biomedical Engineering,Schoolof BiologicalScienceand Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China

Objective To explore the physiological characteristicsof synaptic transmission of anteriorhorn early development in thoracic spinal cordmediated byα-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid(AMPA)receptors in rats.Methods 36Wistar ratswere divided into embryonic 17 days group(E17,n=12),embryonic 20 days group(E20,n=12)and postnatal7 days group(P7,n=12).Immunofluorescentstaining of calmodulin-dependentprotein kinaseⅡ(CaMKⅡ)was used to test the distribution of AMPA receptors.Multi-electrode array technique(MED-64 system)wasused to test the changesof field excitatory post-synaptic potential(fEPSP)of synaptic transm issionmediated by AMPA receptor.Results Therewas small amount of CaMKⅡ-positive neurons existing in graymatter of spinal cord at E17,CaMKⅡ-positive neurons migrated to the center,and the number of neurons becamemore andmore in E20 and P7 rats.The number of evoked fEPSPgradually increased in rats from E17 to P7,and could be blocked by 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione(CNQX).The range of synaptic connection in spinal cord graymatter significantly reduced(P＜0.001).Conclusion AMPA receptors participate in the early developmentof spinal cord in ratsand actas themain excitatory receptorof functionalsynaptic connection in neuralnetwork of ventricornu.

α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor;spinal cord development;field excitatory postsynaptic potential;synaptic connection;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.12.005

R651.2

A

1006-9771(2015)12-1385-06

1.國家 “863”計劃項目(No.2012AA020206)；2.國家自然科學基金面上項目(No.31271037)；3.國家自然科學基金國際合作與交流項目(No.31320103903)；4.“十二五”國家科技支撐計劃項目(No.2012BAI17B04)；5.高等學校全國優秀博士學位論文作者專項資金資助項目(No.201356)；6.國家國際科技合作專項項目(No.2014DFA30640)；7.國家自然科學基金委員會資助項目(No.31130022)。

1.首都醫科大學神經生物學系，北京市100069；2.北京航空航天大學生物醫學工程學院，北京市100191。作者簡介：張雯秀(1989-)，女，新疆克拉瑪依市人，碩士研究生，主要研究方向：AMPA受體在發育及脊髓損傷大鼠胸段脊髓中的表達情況及分布規律。通訊作者：李曉光(1959-)，男，吉林長春市人，博士，教授，主要研究方向：應用組織工程學方法修復神經系統損傷的研究。E-mail:lxgwelcome@263. net。

先前研究發現，發育過程中AMPA受體在胚胎期及新生大鼠的中樞神經系統(central nervous system, CNS)中表達，并隨著年齡的增長而逐步發育完善[4-5]。早期研究主要集中于探討大腦中AMPA受體的作用機制及生理生化特征[6-7]，并發現AMPA受體功能的改變導致大腦學習和記憶功能的減弱和喪失[8]。目前對于脊髓中AMPA受體能否參與突觸傳遞，以及AMPA受體在參與形成神經網絡的過程中的作用機制尚未有明確的報道。

本實驗利用免疫熒光染色觀察脊髓前角中鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinase II,CaMKⅡ)陽性神經元的形態、分布及變化規律，采用電生理MED64平面微電極陣列技術檢測發育期AMPA受體介導的神經網絡活動變化，結合藥理學檢測AMPA受體在不同發育階段的興奮性特征，以探討AMPA受體參與大鼠脊髓發育早期突觸傳遞的生理學特點。

2015-09-18

2015-10-10)