HPLC法測定茵陳提取物中綠原酸的含量

張昀 張艷萍 何峰

（貴州瑞和制藥有限公司，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550004）

舒肝寧注射液是由茵陳提取物、梔子提取物、板藍根提取物等制備而成的中藥復方制劑，主要功效為清熱解毒，保肝護肝［1－2］，所含成份較為復雜，因此為了控制舒肝寧注射液成品質量的均一性，對于其組方中各種提取物的質量控制尤為重要。綠原酸是一種重要的生物活性物質，具有抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤、降血脂、清除自由基等作用［3］。本文以舒肝寧注射液中君藥茵陳提取物為研究對象，用高效液相色譜測定綠原酸的含量，用于茵陳提取物及舒肝寧成品的質量控制。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（島津LC－10AT，Sepu3000色譜工作站，SPD－10A 紫外檢測器）；電子天平（GR－202型，日本A＆D 公司）；綠原酸對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號：0753－200111）；甲醇（分析純）；乙腈（色譜級）；磷酸（分析純）；茵陳提取物（貴州瑞和制藥有限公司，批 號：T－Y030409、TY030512、T－Y030701、T－Y030828、T－Y031022、TY031112、T－Y040218、T－Y040902、T－Y040905、TY040909）。

2 方法與結果［4］

2.1 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1mL含6μg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取茵陳飲片加水煎煮2次，第1次加飲片8倍量的水，煎煮1.5h；第2次加飲片6倍量水，煎煮1h，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.20～1.25（50 ℃）。分別加入乙醇使含醇量達到60%、80%，減壓回收乙醇濃縮至相對密度為1.25～1.30（50組℃）。按每30g組浸組膏加組水組至100g組計算進行水沉。將水沉物115 ℃熱處理45min，冷至室溫，置于0～10 ℃冷藏不少于10d。水沉液用5μm 鈦棒過濾，除去沉淀，即得茵陳提取物過濾液。取茵陳提取液過濾，精密吸取濾液1 mL，置50mL 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取2 mL，置25 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3 空白溶液制備 取制備供試品溶液的溶劑甲醇，濾過，即得。

2.4 色譜條件與系統適用性試驗 迪馬C18柱（5μm，250mm×4.6mm）；流動相：乙腈－0.4%磷酸（10∶90）；檢測波長327nm；柱溫30 ℃；流速1.0mL／min。理論塔板數按綠原酸計算不低于3 000，分離度＞1.5。

2.5 專屬性試驗 精密吸取綠原酸對照品溶液、供試品溶液、空白溶液各10μL，按上述色譜條件測定。結果表明空白溶液在與綠原酸對照品及供試品溶液相同保留時間處未顯干擾色譜峰。見圖1。

圖1 專屬性試驗圖譜

2.6 線性關系考察 用對照品溶液進行線性范圍試驗，以峰面積為縱坐標，對照品溶液進樣量為橫坐標作線性回歸，回歸方程為Y=1 295 313.5178X－121.1 598，相關系數r為0.9 999。結果表明進樣量在0.0 229～0.137μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.7 精密度試驗 精密吸取濃度為6.8 740μg／mL的綠原酸對照品溶液10μL，重復進樣6次，峰面積平均值為88 283，RSD為0.84%，上述試驗結果表明精密度良好。

2.8 穩定性試驗 精密吸取按“供試品溶液的制備”法新處理的樣液T－Y040218（n=3），分別于0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0h（室溫下放置，每次間隔進樣時樣品溶液避光保存）依法測定，記錄峰面積，結果6次進樣綠原酸峰面積的RSD 為1.14%，表明樣品在5h內穩定。見表1。

表1 穩定性試驗結果（±s，n=3）

表1 穩定性試驗結果（±s，n=3）

2.9 重復性試驗 取茵陳提取物T－Y030701，按“供試品溶液的制備”方法制備6份供試品溶液。按上述色譜條件測定，記錄色譜圖及峰面積，結果RSD 為0.19%。試驗結果表明，重復性良好。見表2。

表2 重復性試驗結果（±s，n=3）

表2 重復性試驗結果（±s，n=3）

2.10 回收率試驗 精密吸取已知綠原酸含量的同批號（T－Y040218）樣品6份，每份0.5mL，置50mL棕色量瓶中，分別精密加入對照品溶液（1.718mg／mL）1mL，加甲醇稀釋至刻度；再精密吸取2mL，置25mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，按上述色譜條件測定計算綠原酸回收率，結果表明綠原酸的平均回收率為98.0%，RSD 為1.77%（n=6）。見表3。

表3 回收率試驗結果（n=6）

2.11 樣品測定 按上述色譜條件測定10批茵陳提取物中綠原酸的含量（表4）。10批茵陳提取物中綠原酸的平均含量根據實際生產需要按總固體折算為17.59mg／g。

表4 樣品的含量測定結果

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 取綠原酸對照品適量加甲醇使溶解，制成每1mL含1 mg的溶液。在190～400nm 波長段進行紫外光譜掃描20min，結果綠原酸在波長327nm 處有最大吸收，故選擇測定波長為327nm。

3.2 流動相的選擇 實驗中對流動相進行了選擇，其中使用乙腈－水（10∶90）峰型差，樣品分不開；使用乙腈－0.3%磷酸溶液（10∶90），峰型差，樣品分離度差；乙腈－0.4%磷酸溶液（9∶91），峰型好但出峰時間晚。結果選用本實驗條件下的乙腈－0.4%磷酸（10∶90），峰型好，樣品分離度好，分離度＞1.5，出峰時間合適。

本實驗結合藥典建立了茵陳提取物中綠原酸的含量測定方法，并進行了方法學考察，結果表明所建立的方法結果可靠，10批茵陳提取物樣品中綠原酸的含量在13.17～20.42mg／g之間，本方法可為進一步提升茵陳提取物和舒肝寧注射液的質量標準提供試驗參考。

［1］關妮.舒肝寧注射液臨床應用進展［J］.醫學理論與實踐，2014，27（10）：1291－1295.

［2］王云，羅天永.舒肝寧注射液治療黃疸型肝炎的臨床效果觀察［J］.護士進修雜志，2010，25（8）：744－745.

［3］鄧良，袁華，喻宗沅.綠原酸的研究進展［J］.化學與生物工程，2005，1（7）：4－6.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：223.