血清高爾基體蛋白73聯合甲胎蛋白檢測在原發性肝癌患者中的診斷價值

崔冉亮 李悅國 張鵬宇 張鵬

·臨床研究與應用·

血清高爾基體蛋白73聯合甲胎蛋白檢測在原發性肝癌患者中的診斷價值

崔冉亮 李悅國 張鵬宇 張鵬

目的：探討高爾基體蛋白73（golgi protein 73，GP73）聯合甲胎蛋白檢測用于原發性肝癌診斷的臨床意義。方法：收集2013年6月至9月天津醫科大學腫瘤醫院160例血清，其中原發性肝癌患者46例，單純肝硬化患者30例，其他消化系統腫瘤患者44例，健康者40例。應用酶聯免疫吸附實驗定量檢測血清GP73水平，電化學發光免疫分析檢測血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平。結果：GP73診斷原發性肝癌的敏感性達到73.9%，與本研究中AFP敏感性（56.5%）相比，前者有顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.01）。GP73和AFP聯合檢測敏感性有顯著提高，可以達到86.9%，與單獨一種相比敏感性有顯著性差異（P＜0.01）。結論：GP73有可能作為原發性肝癌診斷的血清標志物之一，而GP73和AFP的聯合檢測對原發性肝癌的診斷也有較好的應用價值。

腫瘤標志物 GP73 甲胎蛋白 肝細胞癌

原發性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）惡性程度高、進展快、預后差、侵襲性強，是我國常見的惡性腫瘤之一，已成為一個世界性難題，其發病率在全球位居第4位，總患者數約56.4萬［1］。但是原發性肝癌的發病比較隱匿，初期患者無明顯癥狀，但當就診癥狀明顯時，可能已經發展至原發性肝癌的晚期，所以在治療上成為一個很大的難題，導致5年生存率低、治愈率不高的不良后果。

在過去相當長的時間里，甲胎蛋白（AFP）是唯一被推薦用于原發性肝癌監測的血清標志物［2-4］。回顧性分析認為，AFP作為早期原發性肝癌監測工具，敏感度為39%～64%，特異度為76%～91%，陽性預測值為9%～32%［5-7］，因此其作為早期診斷的手段并不理想；另外，肝臟超聲用于臨床研究中原發性肝癌診

斷時，通常難以發現、確認＜3 cm的腫塊，而且肝臟超聲受到操作者影響，限制其應用價值，從而不能作為一種監測性檢驗方法［8-9］。因此，臨床上迫切需要找到一種更加靈敏的血清腫瘤標志物應用在檢測原發性肝癌。在新近的報道中發現，在原發性肝癌患者血清中，GP73水平顯著提高，而且對于原發性肝癌的診斷，GP73也比AFP出現更早［10］。本研究主要評估血清GP73和AFP聯合檢測對于原發性肝癌診斷的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1材料

收集2013年6月至9月間在天津醫科大學腫瘤醫院就診的160例血清，其中原發性肝癌患者46例，單純肝硬化患者30例，其他消化系統腫瘤患者44例（胃癌23例，結直腸癌21例），其中男性59例，女性61例；年齡35～75歲，平均年齡為55歲。均經本院病理科病理學檢測確診，在此基礎上分別檢測了每例患者的GP73以及AFP含量。選取40例健康者為正常對照，入選者無肝、腦、心、腎等主要臟器疾病，年齡32～68歲，平均年齡50歲。

1.2方法

1.2.1標本采集采用帶有分離膠的進口真空采血管取患者空腹靜脈血4 mL，離心力3 000 rpm，離心5 min取血清待測。

1.2.2檢測方法甲胎蛋白（AFP）的測定：采用Roche E170電化學發光免疫分析儀及配套試劑盒（瑞士Roche公司）檢測血清AFP濃度，操作嚴格按照儀器和試劑說明書進行，并且高低質控品均在要求范圍內。參考值為20 ng/mL，當患者血清水平超出臨界值時判定為陽性。

高爾基體蛋白73（GP73）的測定：GP73檢測所用試劑盒由北京熱景公司提供，采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清GP73的濃度。試劑盒內設GP73標準品0、20、50、100、250 ng/mL。酶標板上預包被抗GP73單抗，與樣本中GP73反應結合，再加入HRP標記GP73多抗，用TMB底物顯色，顯色濃度與樣品中GP73的濃度呈正比。通過酶標儀檢測樣本的吸光度（A）值，按已知GP73標準品，計算出樣品中GP73的含量。操作嚴格按照規程，結果按說明書規定＞100 ng/mL為陽性。試劑線性為0～250 ng/mL。對＞250 ng/mL的樣本，使用配套稀釋液手工稀釋后再檢測。

1.3統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行數據處理。組內GP73以及AFP比較用t檢驗，不同組間GP73以及AFP比較予以單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1GP73與原發性肝癌臨床因素的相關性

從表1中可以看出，原發性肝癌患者血清GP73的表達水平與性別、年齡、甲胎蛋白濃度、腫瘤直徑、結節數目、TNM分期均無關，各組比較均無統計學差異（P＞0.05）；與是否合并肝硬化有關，兩組差異有統計學意義。GP73在肝硬化和肝癌病變細胞中表達屬同向協同作用，也有相關文獻顯示P73在肝硬化中表達上調，但其升高程度遠不及原發性肝癌［8］。所以，可將GP73作為預測原發性肝癌的檢測指標。

表1 GP73在原發性肝癌的臨床指標Table 1Expression of GP73 in primary hepatocellular carcinoma of different clinical characteristics

2.2GP73和AFP檢測陽性率結果

各組人群GP73和AFP檢測陽性率結果見表2。本研究陽性率指敏感性，即患者中得出陽性檢測的樣本占患者總數的百分比。診斷原發性肝癌GP73的敏感性達73.9%，與本研究中AFP敏感性（56.5%）相比，前者有顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.01）。而在單純肝硬化組和其他消化系統腫瘤（主要是指胃癌和結直腸癌）組中，GP73和AFP檢測陽性率分別為36.7%、6.8%和43.3%、9.1%，說明GP73對于肝癌的診斷有特異性，而對于單純肝硬化和其他消化系統腫瘤則意義不明顯。健康人群中GP73和AFP敏感性均為0，綜上說明GP73與過去唯一推薦原發性

肝癌檢測指標（AFP）一樣，可以作為原發性肝癌的診斷指標之一。

表2 各組人群GP73和AFP檢測敏感性（陽性率）Table 2Sensitivity of GP73 and AFP in different groups

2.3原發性肝癌患者中GP73和AFP的ROC曲線

繪制ROC曲線，確定最佳臨界值，并鑒定GP73和AFP在區分HCC患者的敏感度和特異度。GP73的ROC曲線下面積（AUROC）為0.849（95%CI：0.719～0.980），敏感度為74%，特異度為73%；而AFP的AUROC為0.732（95%CI：0.575～0.890），敏感度為57%，特異度為98%；GP73的曲線下面積（AUROC）大于AFP。通過比較兩者的ROC曲線，發現GP73明顯優于AFP（圖1）。

圖1 PHC中GP73和AFP的ROC曲線分析Figure 1ROC curve of the GP73 and AFP in PHC

2.4GP73和AFP聯合檢測陽性率結果

單純肝硬化GP73和AFP聯合檢測僅為53.3%，GP73和AFP聯合檢測敏感性有顯著提高，可以達到86.9%，與單獨一種相比敏感性有顯著提高，差異有統計學意義（P＜0.01）。計算各組約登指數原發性肝癌組、單純肝硬化組和其他消化腫瘤組分別為0.764、0.318和-0.004，指數越大說明篩查實驗的效果越好，真實性越大，所以將GP73和AFP聯合用于原發性肝癌的檢測更能提高檢出率。各組人群GP73和AFP聯合檢測陽性率結果見表3。

表3 各組人群GP73和AFP聯合檢測陽性率Table 3Positive rate of GP73 and AFP in different groups

3 討論

AFP是原發性肝癌的重要標志物，現已廣泛應用于臨床，然而有相當一部分原發性肝癌患者的AFP檢測結果呈陰性。有報道約30%肝細胞癌患者AFP不升高，其原因可能是此類腫瘤細胞分化程度接近正常或者壞死程度嚴重，這些高危人群癌組織中產生大量結締組織，這樣AFP合成的含量減少［11］。

不僅高分化或分化很差的肝癌細胞往往不產生AFP使得原發性肝癌的診斷呈假陰性，其他一些疾病也可能引起甲胎蛋白的升高，特別是慢性肝炎以及肝硬化［9］，這樣致使原發性肝癌假陽性概率也增高。另外影像學檢查局限性很多，如肝臟超聲用于早期原發性肝癌患者診斷時，通常未能及時準確診斷，這樣使得患者錯過了最佳的治療時機。因此，臨床期待一種更好的血清標志物進行有價值的肝癌診斷。

近年來蛋白組學的飛速發展使得一些新型腫瘤標志物的發現成為可能［12］。有報道介紹一種新的高爾基體跨膜糖蛋白GP73，指出這種蛋白的上調和原發性肝癌有著密切關系［13］。之后有關GP73的研究報道不斷出現。高爾基體糖蛋白73（GP73）是一種高爾基體Ⅱ型跨膜蛋白，在多種組織的內皮細胞中表達。通常在正常的肝臟組織內GP73很少出現表達，主要在膽管上皮細胞中表達［14］。但在肝臟癌變狀態下，GP73在肝細胞中表達顯著上調，外周血中含量顯著上升［15-16］。因此本研究主要采用手術或病理確診的肝細胞癌患者，并且系原發腫瘤非轉移患者。

本研究應用雙抗體夾心ELISA的方法檢測血清中GP73的濃度，檢測方法簡單快速，便于操作，標準曲線線性關系良好，質控接近靶值，所得結果較為可靠。原發性肝癌組臨床資料顯示GP73的表達結果與性別、年齡、肝臟腫瘤組織的大小、分化程度、臨床分期及血清AFP水平無關聯，僅與有無肝硬化相關，可能由于合并肝硬化的肝癌患者肝細胞直接損傷更加嚴重，而GP73可能同肝細胞損傷直接相關，這也是初期發現GP73所提示的意義所在。因此，這類患者癌周不典型增生的癌細胞較多，而引起GP73在發生病

變的肝細胞中表達上調所致。但是研究病例較少，需要進行大樣本確證性試驗。

本研究收集了一些非肝臟疾病的其他消化系統腫瘤患者，主要為胃癌和結直腸癌，發現其GP73水平同正常人無明顯區別，可作為共同對照組，這同時也表明了GP73升高有肝細胞特異性，可能同非肝臟的其他消化系統疾病無直接關聯。

根據ROC曲線可見，GP73診斷PHC的敏感性達到73.9%，與本研究中AFP敏感性（56.5%）相比，前者有顯著增高，而曲線下面積顯示，GP73的性能明顯優于AFP。46例原發性肝癌患者中20例GP73陽性，而AFP陰性的20例原發性肝癌患者中，GP73表達陽性例數達14例，這表明AFP處于正常水平，或者是AFP低水平的某些原發性肝癌患者，AFP檢測可能影響治療評估和監測，而用GP73進行診斷是有價值的。兩者聯合檢測的敏感度提高至86.9%，而特異度保持在較高水平（89.5%），這樣也大幅降低了AFP陰性病例的漏檢率。因此，在未找到新的肝癌標志物前，GP73具有良好的臨床應用價值，有望成為肝癌的診斷標志物。

研究表明GP73升高可能與原發性肝癌發生時小膽管上皮細胞的破壞或內皮細胞增殖有關［17］，但是本研究大部分采用手術或病理確診的肝細胞癌，膽管細胞癌例數較少；有研究指出GP73水平升高是由于HBV感染導致［15］，而有研究則認為并非此病毒感染引起［18］及GP73的升高是否與肝硬化直接相關；另外本研究驗證方法不多，今后的研究不僅包括臨床病例，還需要增加更多包括分子PCR或者蛋白免疫印跡等檢測方法，關于GP73的臨床應用價值需要進一步探討。

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（2014-08-20收稿）

（2014-10-05修回）

（編輯：周曉穎）

Combined detection of alpha-fetoprotein and Golgi protein 73 for primary hepatic carcinoma diagnosis

Ranliang CUI,Yueguo LI,Pengyu ZHANG,Peng ZHANG

Peng ZHANG;E-mail:laopang.56@163.com

Objective:The diagnostic sensitivity of alpha-fetoprotein(AFP)in patients with primary liver cancer is poor and unsatisfactory in the clinical diagnosis of patients with primary liver cancer.Recent studies have demonstrated the upregulation of serum primary hepatic carcinoma(PHC)and Golgi glycoprotein 73(GP73)in patients with PHC.This study aims to discuss the clinical significance of GP73 and AFP in the serum on the diagnosis of primary liver cancer.Methods:The serum concentrations of GP73 and AFP were retrospectively analyzed in 46 hepatocellular carcinoma patients,30 cases of patients with liver cirrhosis alone,44 patients with other digestive tumors,and 40 healthy subjects as controls.Quantitative euzymelinked immunosorbent assay and electrochemiluminescence immunoassay were conducted to determine the GP73 and AFP levels in the serum,respectively.Results:The sensitivity of PHC diagnosis significantly increased with GP73(73.9%)compared with AFP(56.5%),and the difference was statistically significant(P< 0.01).The sensitivity of AFP combined with GP73 significantly improved to 86.9%compared with the sensitivity of a single indicator (P<0.01).Conclusion:GP73 may be used as one of the PHC serum markers for diagnosis.The combined detection of GP73 and AFP offers great potential for future application in the diagnosis of PHC.

tumor marker,Golgi protein 73,alpha-fetoprotein,hepatocellular carcinoma

10.3969/j.issn.1000-8179.20140757

天津醫科大學腫瘤醫院檢驗科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，國家“863”計劃臨床研究實驗室（天津市300060）

張鵬laopang.56@163.com

Department of Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,National"863"Plan Clinical Research Laboratory,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin300060,China

崔冉亮專業方向為腫瘤標志物檢測。

E-mail：cuiranliang@163.com