腫瘤間質比及腫瘤浸潤性淋巴細胞對晚期結直腸癌的預后價值

張溪胡柏來呂震馬廣貞陳麗榮

·臨床研究與應用·

腫瘤間質比及腫瘤浸潤性淋巴細胞對晚期結直腸癌的預后價值

張溪①胡柏來①呂震②馬廣貞③陳麗榮①

目的：研究結直腸癌腫瘤間質比（tumor-stroma ratio，TSR）及腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）與結直腸癌患者的預后相關性。方法：收集浙江大學醫學院附屬第二醫院病理科2007年1月至2009年12月手術切除的原發性Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌218例病理資料進行回顧性分析，通過HE染色評估腫瘤組織中間質成分所占比例及淋巴細胞浸潤情況，并分析不同分組對患者預后生存的影響。結果：218例Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌患者中低TSR組總體生存率明顯高于高間質組（P＜0.05）。TSR與各項臨床特征及病理指標，如性別、年齡等無關（P＞0.05）。TSR及TIL均為Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌患者的獨立預后因子。高淋巴細胞浸潤組患者總體生存率明顯高于低淋巴細胞浸潤組患者，在低間質組中高淋巴細胞浸潤組的患者總體生存率高于低淋巴細胞浸潤組患者（P＜0.05）。結論：腫瘤間質比及腫瘤浸潤性淋巴細胞對結直腸癌預后均相關，在常規病理診斷中通過對這兩項指標的綜合評估，可作為輔助指標對結直腸癌患者的預后預測、臨床治療選擇提供依據。

結直腸癌 腫瘤間質比 腫瘤浸潤性淋巴細胞 預后

1Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310009,China;

2Division of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery,Department of Surgery,the First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310009,China;

3Department of Pathology,the Second People's Hospital of Liaocheng Affiliatedto Taishan Medical College,Liaocheng 252601,China

隨著經濟的發展、人們生活方式的轉變，結直腸癌的發病率逐年增多，目前其發病率已在惡性腫瘤中居第三位，死亡率第五位［1］。目前，國內外仍采用TNM分期對大腸癌的浸潤程度、淋巴結轉移、遠處轉移情況作出評估，指導臨床治療手段。然而事實上，相同分期的患者臨床預后也可能極大不同，病理特征可能是造成這種差別的重要原因之一。

癌細胞周圍的腫瘤間質成分起著支持和營養腫瘤實質的作用，為腫瘤生長所必須，在腫瘤的生物學行為中發揮著重要作用。腫瘤間質微環境可直接影響腫瘤細胞的黏附、遷移、增殖、分化、侵襲等生物學行為，與此同時，腫瘤間質又直接或間接受到腫瘤細胞的影響與調節［2］。近年來腫瘤間質比（tumor-stroma ratio，TSR）在結直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中

的預后作用逐漸受到關注和證實［3-4］。腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）是腫瘤微環境中一類重要細胞，國內外已有大量文獻報道了腫瘤浸潤性淋巴細胞的抗腫瘤作用。本研究重點分析腫瘤間質比及淋巴細胞浸潤情況與Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌患者預后之間的關系。

1 材料與方法

1.1一般資料

收集浙江大學醫學院附屬第二醫院病理科2007年1月至2009年12月手術切除的原發性Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌標本218例，其中男性145例，女性73例；男女比例1.9：1。患者年齡平均62.1（25～86）歲。按照UICC分期委員會提出的TNM分期標準，分為Ⅱ期107例（49.1%），Ⅲ期111例（50.9%）。所有病例均未進行術前放化療（表1）。本研究排除多發性腫瘤、復發性腫瘤、非腫瘤性死亡病例、生存時間＜3個月的病例、微乳頭狀癌、鋸齒狀腺癌等少見類型結直腸癌病例。

表1 Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌TSR與臨床病理特征的關系Table 1Correlations between TSR and clinicopathologic features in stagesⅡandⅢcolorectal cancer

1.2方法

1.2.1腫瘤間質比判定采用雙盲法由2名未知患者信息的病理醫生對實驗結果根據Mesker等［5］提出的方法進行判定：將原發腫瘤浸潤最多的部位切取制作成5 μm常規HE病理切片。在低倍鏡下（×40）選取腫瘤浸潤最明顯的區域，然后在高倍鏡下（×100）判定單視野內腫瘤所占該視野的百分比（carcinoma percentage，CP），而該視野范圍四周均應有腫瘤細胞浸潤。每個視野的腫瘤比例以10%為區間值（如10%、20%、30%等），盡量避開壞死或黏液區域。通過評估視野內腫瘤所占比，可以得出該視野內間質所占百分比（stroma percentage，SP）（如某一視野內CP值為30%，則該視野內SP值為70%）。選取至少2個視野進行評估，取SP最高值作為終值。腫瘤組織中SP≤50%為低間質組，SP＞50%為高間質組（圖1）。對于初步評估SP介于40%～60%的樣本，通過對比相鄰腺管間間質距離與腺管的寬度進行評估：若腺管間間質距離大于腺管寬度，則為高間質；若腺管間間質距離小于腺管寬度，則為低間質。

圖1 結直腸癌不同腫瘤間質比（H&E×100）Figure 1Different TSR of colorectal cancer（H&E×100）

1.2.2淋巴細胞浸潤情況判定實驗結果采用Huh等［6］的判定方法：在顯微鏡下觀察HE病理切片，在腫瘤浸潤最明顯的區域將TIL按浸潤程度分為4級：0級：無淋巴細胞反應；1級：可觀察到散在淋巴細胞；2級：可觀察到中度淋巴細胞反應或淋巴細胞帶狀浸潤；3級：大量淋巴細胞浸潤，破壞腫瘤細胞的連續性。然后根據浸潤情況的不同將病例分為低TIL組（0～1級）和高TIL組（2～3級）（圖2）。

1.2.3隨訪部分病例由浙江大學醫學院腫瘤研究所提供完整臨床隨訪資料，其余病例通過查閱病案室檔案或電話的方式獲得患者的預后資料，隨訪至2014年2月28日或患者死亡，隨訪率為85.7%。

圖2 結直腸癌中腫瘤浸潤性淋巴細胞（H&E×100）Figure 2Tumor-infiltrating lymphocytes in colorectal cancer（H&E×100）

1.3統計學方法

應用SPSS 20.0統計分析軟件，計數資料用Pearson卡方檢驗，患者預后分析采用Cox比例風險模型單因素和多因素分析，生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，組間差異采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1患者基本病理特征

218例結直腸癌中高間質組58例（26.6%），低間質組160例（73.4%）。TSR在性別、年齡、腫塊部位、腫塊大小、淋巴細胞浸潤、T分期、淋巴結轉移、脈管浸潤、神經侵犯、臨床分期間差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。根據對淋巴細胞浸潤情況的判定結果，218例結直腸癌中168例（77.1%）為低TIL組，50例（22.9%）為高TIL組。

2.2TSR、TIL與結直腸癌預后關系

對218例結直腸癌患者隨訪至2014年2月28日或患者死亡，高間質組28例死亡（48.3%），中位生存時間為54.0個月；低間質組46例死亡（28.8%），中位生存時間為60.5個月。Kaplan-Meier生存分析顯示，兩組結直腸癌患者的總體生存時間有顯著性異（χ2=9.730，P=0.002，圖3）。低TIL組與高TIL組患者的中位生存時間分別為60.8、75.3個月，兩組結直腸癌患者的總體生存時間間有顯著性差異（χ2=6.772，P=0.009，圖4）。Cox單因素分析顯示，TSR、TIL、淋巴結轉移、臨床分期為腸癌患者的生存相關因素（表2）。Cox多因素分析顯示，TSR、TIL與淋巴結轉移為結直腸癌患者的獨立預后因素，而性別、年齡、腫塊部位、腫塊大小、T分期、脈管浸潤、神經侵犯并非結直腸癌獨立預后因素（表3）。

圖3 不同TSR患者的Kaplan-Meier生存分析Figure 3Kaplan-Meier survival curves of OS of stroma-high versus stroma-low in colorectal cancer

圖4 不同TIL浸潤的患者Kaplan-Meier生存分析Figure 4Kaplan-Meier survival curves of OS of different tumor-infiltrating lymphocytes groups in colorectal cancer

表2 Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌患者預后Cox單因素分析Table 2Univariate Cox regression analysis of prognostic factors in stagesⅡandⅢcolorectal cancer

表2 Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌患者預后Cox單因素分析（續表2）Table 2Univariate Cox regression analysis of prognostic factors in stagesⅡandⅢcolorectal cancer

表3 Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌患者預后Cox多因素分析Table 3Multivariate Cox regression analysis of prognostic factors in stagesⅡandⅢcolorectal cancer

2.3TSR與TIL對結直腸癌的預后作用

將218例結直腸癌患者分為3組：高危組：全部高間質組病例；中間組：同時屬于低間質組和低TIL組的病例；低危組：同時屬于低間質組和高TIL組的病例（表4）。3組中位生存時間分別為53.2、64.8、77.7個月。Kaplan-Meier生存分析顯示，各危險組結直腸癌患者的總體生存時間之間有顯著性差異（χ2=13.656，P=0.001，圖5）。

圖5 不同風險組（TSR+TIL）的患者Kaplan-Meier生存分析Figure 5 Kaplan-Meier survival curves of OS in different risk groups in colorectal cancer

表4 基于TSR與TIL的風險分組對結直腸癌的預后影響Table 4Risk grouping based on TSR and TIL for the prognosis of colorectal cancer

3 討論

腫瘤微環境中的細胞由腫瘤細胞、原有的以及浸潤的非腫瘤細胞構成，腫瘤細胞與非腫瘤細胞通過多種細胞因子、信號通路等相互作用，建立復雜的調控機制［7］。在這一過程中，包括淋巴細胞在內的多種免疫細胞也發揮著重要的作用［8］。

近年來國內外對腫瘤間質在腫瘤的發生、侵襲、轉移過程中所發揮的作用，以及腫瘤間質與患者臨床預后的關系不斷有了新的認識。Mesker等［3，5］回顧性觀察分析了腫瘤組織中腫瘤成分所占比（carcinoma percentage，CP）及間質成分所占比（stroma percentage，SP）與結直腸癌的預后關系，并以50%為CP的cut-off值，結果顯示低CP患者的總體生存率和無病生存率均低與高CP患者，首先提出TSR為結直腸癌的獨立預后因子。Huijbers等［9］通過對710例原發性結直腸癌進行分析，同樣以50%為界將所有病例分為高間質（stroma high）及低間質（stroma low）兩組，結果顯示高間質患者的總體生存率及無病生存率較低間質患者明顯降低。此研究710例結直腸癌患者中433例高?；颊呓邮苓^術前化療（chemotherapy treatment，CT），通過對CT亞組的分析進而發現對于接受過術前化療的高?；颊?，高間質同樣與患者的不良預后相關，總體生存率及無病生存率明顯降低（P＜0.05）。West等［10］通過數字切片技術分析結直腸癌中TSR與患者預后的關系，也得出類似的結論。在隨后的文獻研究結果顯示TSR不僅與結直腸癌患者的預后密切相關，對乳腺癌、宮頸癌、食管腺癌等多種實體腫瘤同樣具有預后作用［4，11-12］。本研究通過對218例Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌患者手術標本HE切片觀察分析，結果顯示高間質組患者總體生存率明顯低于低間質組，TSR可以作為結直腸癌的獨立預后因子，與以往的研究結果相一致。

腫瘤間質是由一系列細胞，包括成纖維細胞/肌成纖維細胞、免疫細胞、膠質細胞、上皮細胞、肥大細胞等與細胞外基質（EMC）及細胞外分子所組成。這些非腫瘤細胞間的相互作用、直接或間接與腫瘤細胞間相互作用激活各種分子信號通路，不僅使其自身獲得異常表型或功能轉化，同時也使腫瘤間質發生功能改變，從而促進腫瘤的發生發展［8］。腫瘤相關纖維母細胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）是腫瘤間質的重要成分，參與腫瘤細胞外基質合成，并可以通過多種細胞因子、生長因子、炎癥介質促進上皮細胞增殖，調節腫瘤細胞的生物活性，在腫瘤的發生、侵襲、轉移中發揮重要作用［13-14］。已在多種腫瘤組織中被證實，腫瘤纖維母細胞表型與正常纖維母細胞相比CD34表達缺失而α-SMA表達升高。有研究顯示纖維母細胞的突變早于上皮細胞突變而獲得致瘤性，促進上皮細胞惡性轉化，而腫瘤的發生又能夠反過來刺激周圍正常纖維母細胞發生表型改變，最終二者共同促進腫瘤發生發展［15-16］。研究發現CAFs不僅可以刺激腫瘤細胞增殖，還可以通過HGF、TGF-β等生長因子參與腫瘤血管生成，增強腫瘤侵襲浸潤能力［17］。以上研究結果提示腫瘤間質可以通過CAFs參與腫瘤的侵襲轉移過程，這可能是高間質結直腸癌預后不良的重要原因之一。

本研究對腫瘤組織淋巴細胞浸潤情況進行分析，結果顯示高TIL患者的總體生存率明顯高于低TIL患者，提示TIL是Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌患者的良好預后因子。將本研究低間質組的患者根據TIL的不同分為低危組（低間質+高TIL）及中間組（低間質+低TIL）與高危組（高間質）患者共同進行生存分析，結果顯示低危組患者的總體生存率最高，中間組次之，高危組最低。生存曲線顯示在低間質組患者中，高TIL組的患者的總體生存率明顯高于低TIL組患者，提示低間質患者的預后差異可能是由淋巴細胞浸潤情況不同所引起的。

腫瘤的發生發展也是腫瘤細胞與宿主相互平衡、相互適應的過程。腫瘤細胞通過分泌各種細胞因子如TSP-1、TGF-β、MMP等，可以直接或間接產生免疫耐受和免疫抑制以促進腫瘤的侵襲、轉移過程［18］。而在腫瘤組織中及腫瘤浸潤邊緣出現的炎細胞反應被認為是一種宿主抵抗癌細胞的免疫反應［19］，腫瘤間質中的TIL可以識別腫瘤細胞，產生較強的抗腫瘤效應，往往與患者的較高生存率相關［20］。早在1987年腫瘤浸潤性免疫細胞已被提出可作為結直腸癌的獨立預后因子［21］，近年來大量文獻報道了腫瘤浸潤性免疫細胞在其他腫瘤如乳腺癌、卵巢癌中的預后作用［22-23］。有研究顯示CD3+、CD8+T細胞在腫瘤免疫調節中發揮著重要作用，TIL細胞殺傷腫瘤細胞主要通過CTL細胞的激活［24-25］。也有國內外研究認為TIL憑借其抗腫瘤作用有可能成為免疫治療中新的高效抗瘤效應細胞［26-27］。

綜上TSR、TIL均為結直腸癌的獨立預后因子，兩項參數的綜合分析對結直腸癌患者有較強的預后指導作用。腫瘤間質中各種成分間的相互作用與制衡形成了復雜的調控網絡，目前對TSR與TIL之間的具體作用仍未完全清楚，若將其作為一項結直腸癌病理診斷的常規輔助參數，可為臨床治療方案制定、預后判斷提供更加完善、更加準確的依據。

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（2014-12-25收稿）

（2015-01-20修回）

（編輯：鄭莉）

Prognostic values of tumor-stroma ratio and tumor-infiltrating lymphocytes in stagesⅡandⅢcolorectal cancer

Xi ZHANG1,Bailai HU1,Zhen LV2,Guangzhen MA3,Lirong CHEN1

Lirong CHEN;E-mail:chenlr999@163.com

Objective:To investigate the prognostic values of tumor-stroma ratio and tumor-infiltrating lymphocytes in colorectal cancer.Methods:A total of 218 stageⅡorⅢprimary colorectal cancer patients were analyzed for the tumor-stroma ratio(TSR) and tumor-infiltrating lymphocytes(TIL)by using HE stained histological sections.The relationship between TSR and clinicopathologic variables and the difference in clinical outcomes of different groups were also analyzed.Results:Overall survival rates for the stroma-low group were significantly higher than the stroma-high group in stagesⅡandⅢcolorectal cancer(P<0.05).However,the differences in TSR were not correlated with clinicopathologic features such as gender and age(P>0.05).Overall survival rates of patients with high TIL were significantly higher than patients with low TIL(P<0.05).Patients with high TIL had notable better prognosis than patients with low TIL(P<0.05)in the stroma-low group.Conclusion:TSR and TIL are independent prognostic factors for stagesⅡandⅢcolorectal cancer.The combined estimates of TSR and TIL in routine pathology diagnoses may provide more evidence to predict the prognosis of stagesⅡandⅢcolorectal cancer.

colorectal cancer,TSR,TIL,prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.20142129

①浙江大學醫學院附屬第二醫院病理科（杭州市310009）；②浙江大學醫學院附屬第一醫院肝膽胰外科；③泰山醫學院附屬聊城市第二人民醫院病理科

陳麗榮chenlr999@163.com

張溪專業方向為大腸癌的分子機制、早期診斷及個體化治療。

E-mail：［K V YJ BPYJ”126.com