臨床分離廣泛耐藥鮑曼不動桿菌同源性分析及常見耐藥基因檢測

孫 晴， 張正銀

·論著·

臨床分離廣泛耐藥鮑曼不動桿菌同源性分析及常見耐藥基因檢測

孫 晴， 張正銀

目的 了解上海市同仁醫院臨床分離廣泛耐藥鮑曼不動桿菌的基因同源性及耐藥機制，為廣泛耐藥鮑曼不動桿菌感染的防治提供依據。方法 采用腸桿菌科基因間重復序列聚合酶鏈反應（E RIC-PC R）對臨床分離的28株廣泛耐藥鮑曼不動桿菌進行分子生物學分型，采用PC R方法檢測9種常見β內酰胺酶基因：blaK PC、blaI M P、blaVI M、blaN D M-1、blaO X A-23、blaO X A-24、blaO X A-48、blaO X A-51和blaO X A-58；膜孔蛋白基因CarO；插入序列IS Aba1；以及IS Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58的連鎖檢測。結果 28株臨床分離的廣泛耐藥鮑曼不動桿菌大多來自危重患者呼吸道標本，E RIC-PC R基因分型提示為同一來源克隆株；所有菌株均攜帶blaO X A-23、blaO X A-51基因，未檢測出 B類β內酰胺酶基因，以及blaO X A-24、blaO X A-48、blaO X A-58等基因；膜孔蛋白基因CarO和插入序列IS Aba1檢測均為陽性，IS Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58連鎖檢測均未擴增到預期條帶。結論 研究期間臨床分離廣泛耐藥鮑曼不動桿菌為同一克隆株，且攜帶相同耐藥基因，提示存在克隆傳播。

廣泛耐藥； 鮑曼不動桿菌； 同源性； 耐藥基因

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter bau m annii）在環境中廣泛存在，因其具有極強的生存、黏附以及獲得外源性耐藥基因的能力，成為醫院感染常見的機會致病菌。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，以及機械通氣和介入治療等侵襲性操作應用，鮑曼不動桿菌成為我院臨床分離率最高的不發酵糖革蘭陰性桿菌，與上海地區耐藥監測網的數據相符［1］。我院統計數據顯示，2011至2013年廣 泛耐 藥鮑曼不動桿菌（X D R A B）的檢出率不斷上升，分別為5.1%（17株/336株）、6.7%（19株/282株）和14.5%（31株/214株）?？梢姡摼尼t院感染問題日益嚴重。為了解我院X D R A B分子流行病學及部分常見耐藥基因型特征，本研究對臨床非重復分離的28株 X D R A B進行基因同源性及部分常見耐藥基因的檢測分析，以期發現X D R A B傳播以及產β內酰胺酶特點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2013年2—10月我院臨床分離的鮑曼不動桿菌167株（剔除同一患者中分離的重復菌株）。

1.1.2 主要試劑 鮑曼不動桿菌鑒定板條 G N及藥敏板條G N13為法國生物梅里埃公司產品。藥敏紙片為英國O X OID公司產品。質控菌株為大腸埃希菌 A T C C 25922、A T C C 35218，銅綠假單胞菌A T C C 27853。檢測用PC R試劑（Reco m binant Taq D N A Poly merase）為寶生物（大連）公司產品。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 采用 VIT E K2 Compact系統對病原菌進行鑒定及最低抑菌濃度（MIC）測定，采用紙片擴散法（K-B法）測定抑菌圈直徑，并根據美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）2012年M 100-S22標準判定細菌耐藥性，測試抗菌藥物為哌拉西林、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、環丙沙星、左氧氟沙星、甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑、米諾環素和多黏菌素B，共17種。1.2.2 細菌D N A 模板制備 挑取1～2個菌落，加入0.5 m L T E（10 m m ol/L Tris-H Cl，1 m m ol/L E D T A p H 8.0）中混勻，100℃水浴10 min，5 000 g離心5 min取上清液備用。

1.2.3 耐藥基因檢測 各類β內酰胺酶基因PCR檢測引物根據文獻報道序列合成［2-4］，CarO 基因檢測引物根據GenBank公布序列自行設計，見表1。PCR反應體系總體積均為50μL，其中D N A 模板5μL，10×PC R buffer 5μL，dN TPs（各2.5 m mol/L）4μL，引物（20μmol/L）0.5μL，Taq酶（5 u/μL）0.25μL，最后dd H2O補充至50μL；反應參數均為94℃ 預變性5 min，進入循環94℃25 s，52℃40 s，72℃50 s共35個循環，最后72 ℃延伸6 min。IS Aba1F分別與O X A23R、O X A51R 組 合 擴 增 IS Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58連鎖檢測，擴增循環的延伸時間為4 min。擴增陽性產物送上海邁普生物技術公司測序，測序結果與GenBank數據庫中序列進行比對。

表1 PC R引物序列Table 1 Primer sequences used in PC R

2 結果

2.1 菌株來源和分布

2.1.1 標本種類來源 167株鮑曼不動桿菌中有28株對除多黏菌素B外的臨床常用16種抗菌藥物均耐 藥，廣泛耐 藥 株檢 出率 為 16.8%。28 株X D R A B大多分離自呼吸道標本，見表2。

表2 鮑曼不動桿菌的臨床標本來源分布Table 2 Distribution ofAcinetobacter bau m annii isolates by clinical specimen

2.1.2 科室分布 28株X D R A B來源為急診重癥監護病房（IC U）15株，神經外科6株，消化內科3株，呼吸科2株，神經內科1株，心內科1株。

2.2 基因檢測結果

28株X D R A B的E RIC-P C R基因分型結果顯示均為同一克隆株，均未檢測出 A類β內酰胺酶K PC 基因 和B 類 β內 酰胺 酶基 因I M P、VI M、N D M-1，均攜帶有blaO X A-23、blaO X A-51基因，未檢測出blaO X A-24、blaO X A-48、blaO X A-58基因，插入序列IS Aba1及膜孔蛋白基因CarO檢測均為陽性，IS Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58連鎖檢測均未擴增到預期條帶。

3 討論

近年來，鮑曼不動桿菌因其不斷升高的耐藥率以及醫院感染的高發率被稱為“革蘭陰性菌中的M RS A”。在分子流行病學研究中，脈沖場凝膠電泳（PF G E）是細菌分子生物學分型方法的“金標準”，但其設備價格昂貴、試驗周期長、操作技術要求高。本研究采用的E RIC-PC R是一種成本低、操作簡便快速、分 辨 效果 較好、可 重復 性好 的方 法，且與PF G E 結果 一致性 高［5］。本次 28 株 X D R A B 的E RIC-P C R基因分型結果顯示條帶一致，提示為同一克隆株。

本研究收集臨床分離的28株 X D R A B主要來源于急診IC U 以及神經外科，其他科室為散在分布。標本來源以呼吸道為主，提示感染部位多發生在下呼吸道。本組82%患者為60歲以上老年人，免疫功能低下，經調查發現這些急診IC U 和神經外科患者均有氣管插管、機械通氣史，這可能是造成克隆株傳播、流行的主要原因，與厲世笑等［6］的報道相似。另外發現，急診IC U和神經外科的部分床位短期內2次先后從不同患者標本中分離出 X D R A B，提示患者出院后“終末消毒”可能不夠徹底，未能完全殺滅X D R A B。

鮑曼不動桿菌產生的碳青霉烯酶主要為blaO X A-23、blaO X A-24、blaO X A-51和blaO X A-58型 等 D 類酶［7］。 本組X D R A B 全部 攜帶 有blaO X A-23，blaO X A-51 基 因，均 未 檢 測 出blaO X A-24、blaO X A-48、 blaO X A-58。 攜 帶blaO X A-23基因是國內報道鮑曼不動桿菌耐藥的主要機制，而blaO X A-51常為鮑曼不動桿菌天然攜帶［8］。膜孔蛋白CarO的缺失也與耐碳青霉烯類藥物具有相關性［9］。而本組菌株均無CarO 基因缺失，故對碳青霉烯類耐藥與膜孔蛋白基因缺失無關，但不能排除基因表達降低或是突變引起的耐藥性增加。插入序列是最為簡單的轉座子，可攜帶傳遞β內酰胺酶基因、氨基糖苷類修飾酶基因、16SrR N A甲基化酶基因、喹諾酮作用靶位保護蛋白基因、外排泵基因等耐藥基因［10］。甚至IS Aba1插入CarO 基因，致膜孔蛋白CarO基因失活對碳青霉烯類藥物耐藥［11］。IS Aba1作為一種鮑曼不動桿菌特有的插入序列，常伴隨blaO X A-23、blaO X A-51出現，并為其基因表達提供強啟動子［12］。本研究分離 X D R A B菌株均 檢測 出插 入序 列IS Aba1，但IS Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58的連鎖檢測并未擴增到預期條帶，提示兩者不是直接連鎖，但并不能除外間接相鄰，可能與其他耐藥性的形成具有一定相關性。

總之，E RIC-P C R基因分型以及耐藥基因的檢測結果均顯示，我院分離的28株X D R A B具有高度的相似性，親緣關系緊密，為同一克隆株，提示我院存在 X D R A B 的 克隆傳 播，且 攜 帶blaO X A-23、blaO X A-51基因是引起其高耐碳青霉烯類藥物的主要原因之一。臨床上醫務人員必須嚴格執行無菌操作以及環境的消毒，加強對感染或定植患者的監測及隔離，避免在醫院內的進一步傳播。此外，在治療各種感染時，盡量參考藥敏結果合理選用抗菌藥物。同時應加強鮑曼不動桿菌的耐藥監測，及時報告耐藥表型，定期對監測結果進行總結并通報臨床，以便臨床醫師和感染防控人員采取及時、有效的干預措施，以減少細菌耐藥性的產生與傳播。

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Analysis of the genetic homology and resistant genes in clinical isolates of extensively drug-resistantAcinetobacter baumannii

S U N Qing，Z H A N G Zhengyin. （Department of Laboratory M edicine，Tong Ren H ospital，Shanghai 200336，China）

Objective To investigate the genetic ho m ology in clinical isolates of extensively drug-resistantAcinetobacter bau m annii（X D R A B），so as to provide evidence for better controlling hospitalinfections.M ethods The genotypes of 28 clinical X D R A B isolates were determined by Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PC R （E RIC-PC R）.PC R was conducted to analyze 9 types ofβ-lactamase genes（blaK PC，blaI M P，blaVI M，blaN D M-1，blaO X A-23，blaO X A-24，blaO X A-48，blaO X A-51 andblaO X A-58），the outer mem brane porin gene（CarO）and insertion sequence（IS）IS Aba1.W e also carried out linkage analysis forIS Aba1-O X A23 andIS Aba1-O X A58.Results M ost of the above 28 X D R A B strains were isolated fro m respiratory tract specimens fro m intensive care patients.The result of E RIC-PC R showed that there was high ho m ology between all the strains，suggesting that they might derive fro m the same clone.The genesblaO X A-23，blaO X A-51，CarOand the ISIS Aba1 except Class Bβ-lactamase genes，blaO X A-24，blaO X A-48，blaO X A-58，IS Aba1-O X A23 andIS Aba1-O X A58 were detected in all the clinical strains by PC R.Conclusions All the X D R A B isolates belong to the same clone and carry the same drug-resistant genes，indicating that there was clone spread am ong X D R A B isolates.

extensively drug-resistant；Acinetobacter bau m annii；ho m ology；drug-resistant gene

R378

A

1009-7708（2015）01-0028-04

2014-03-11

2014-06-27

上海市同仁醫院檢驗科，上海 200336。

孫晴（1979—），女，主管技師，主要從事微生物檢驗和細菌耐藥性研究。

張正銀，E-mail：zhangzy08@163.co m。