兒童呼吸道分離肺炎支原體藥物敏感性分析

張 泓， 葉信予， 徐曉剛， 王明貴， 劉 楊

·論著·

兒童呼吸道分離肺炎支原體藥物敏感性分析

張 泓1， 葉信予2， 徐曉剛2， 王明貴2， 劉 楊2

目的 了解兒童呼吸道肺炎支原體臨床分離株對常用抗菌藥物的敏感性。方法 采用微量稀釋法測定分離自呼吸道感染患兒的112株肺炎支原體對大環內酯類、四環素類和氟喹諾酮類藥物的敏感性。對肺炎支原體核糖體23S rR N A全序列進行擴增及測序。結果 98株（87.5%）肺炎支原體臨床分離株對紅霉素和阿奇霉素耐藥，耐藥株均存在A2063 G 或A2064 G的23S rR N A核苷酸點突變。四環素類和氟喹諾酮類對肺炎支原體仍具有良好的抗菌活性。結論 呼吸道感染患兒肺炎支原體臨床分離株對大環內酯類耐藥率高，核糖體23S rR N A核苷酸點突變是導致其對紅霉素和阿奇霉素耐藥的原因。

肺炎支原體； 大環內酯類； 四環素類； 氟喹諾酮類； 耐藥性

肺炎支原體（M ycoplasm a pneu moniae）是引起社區獲得性呼吸道感染的主要病原體之一，尤其在學齡期兒童和青少年中［1］。2000年以來大環內酯類耐藥肺炎支原體在全球范圍內報道增多，尤其是東亞地區［2］。本研究對分離自兒童下呼吸道感染患者的肺炎支原體臨床分離株進行藥物敏感性測定，以明確近年來肺炎支原體對常用抗菌藥物的敏感性變化，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與分離培養

痰液標本來自2009年1月—2011年3月上海市兒童醫院呼吸道感染患兒因診斷需要常規留取的鼻咽部吸取物。根據 W aites等［3］2001年描述的方法進行肺炎支原體分離培養，臨床標本直接接種于肺炎支原體SP4液體分離培養基，并繼以1∶10、1∶100梯度稀釋后分離接種于 SP4固體培養基。液體培養基置于37℃孵育，固體培養基置于37℃、5%C O2孵育。同一標本任何稀釋度的液體培養基由清澈變黃色者陽性（分解葡萄糖產酸，p H 值下降），和（或）固體培養基見典型菌落（煎蛋樣）后，顯微鏡下挑取單菌落再次接種于SP4液體培養基，變色后置-80℃保存。

1.2 SP4培養基的配置

根據美國臨床與實驗室標準化協會（C LSI）頒布的關于肺炎支原體藥敏試驗M 43-P 2011年版規程配置SP4液體和固體培養基［4］。SP4液體和固體培養基簡要配方：①基質配方（每1 000 m L）：去離子純水643 m L，不含結晶紫的支原體肉湯培養基3.5 g，胰蛋白胨10.0 g，蛋白胨5.3 g，1%酚紅2.0 m L，Fei魚卵提取D N A 0.2 g；如配置固體培養基加瓊脂15 g。②添加劑配方（每1 000 m L）：熱滅活（56℃30 min）胎牛血清170 m L，25%酵母提取液35 m L，2%酵母自溶液100 m L，50%葡萄糖 10 m L，C M R L 1066-10 X 50 m L。分別配制后，培養基基質121℃20 min滅菌，冷卻后加入經0.22μm濾膜過濾的添加劑，最終p H 值調整至7.4～7.6。液體培養基用于原代培養、菌株保存及藥敏試驗，固體培養基用于純化培養。

1.3 肺炎支原體的分子生物學鑒定

煮沸法提取標本中肺炎支原體 D N A。根據Ieven等［5］描述的針對肺炎支原體 P1黏附蛋白編碼基因設計和合成 PC R引物（5′-G C C A C C C T C GG G G G C A G T C A G-3′和5′-G A G T C G G G A T T C C CC G C G G A G G-3′），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PC R擴增產物大小為209 bp。肺炎支原體標準株 M PF H（A T C C 15531）由北京兒科研究所提供。

1.4 抗菌藥物標準品

藥物敏感性測定所用藥物：紅霉素、阿奇霉素、四環素、多西環素、左氧氟沙星和莫西沙星，均為Sig ma公司標準品。

1.5 最低抑菌濃度（M IC）測定

根據 C LSI M 43-P 2011年版標準規程［4］，采用微量稀釋法測定肺炎支原體對大環內酯類、四環素類和氟喹諾酮類等抗菌藥物的敏感性。受試肺炎支原體的接種量為104～105C F U/m L；紅霉素測定的濃度范圍為0.007～256 m g/L，阿奇霉素為0.007～128 m g/L，四環素類和氟喹諾酮類為0.007～8 m g/L。紅霉素和阿奇霉素M IC≤0.5 m g/L者判定為敏感，＞1 m g/L者判斷為耐藥［4］。設培養基陰性對照和生長對照，當生長對照為陽性而培養基對照保持陰性時讀取M IC值。肺炎支原體標準株M PF H （A T C C 15531）為質控菌株。

1.6 肺炎支原體核糖體23S rR N A基因序列分析

自行設計引物，委托生工生物工程（上海）股份有 限 公 司 合 成 （5′-C A A T A A G T T A C T A AG G G C T T A T G G T G G A T G C-3′，5′-T C C A A T A A GT C C T C G A G C A A T T A G T A T T A C T C A G-3′）， 采用P C R法擴增肺炎支原體23S rR N A全序列，由華大基因科技有限公司測序［6］，以確認各臨床分離株是否存在核糖體核苷酸點突變。

2 結果

2.1 肺炎支原體臨床株分離情況

2009年1月—2011年3月1 235份兒童患者鼻咽部吸取物通過SP4培養基培養，共分離培養到肺炎支原體112株，陽性率為9.1%（112/1 235）。對培養獲得的112株肺炎支原體采用特異性黏附因子P1黏附蛋白引物的PC R擴增，結果顯示112株肺炎支原體均獲得209 bp的特異性黏附因子的擴增條帶，確認為肺炎支原體。

2.2 肺炎支原體對抗菌藥物的敏感性

肺炎支原體臨床分離株對大環內酯類耐藥率高，98株（87.5%）對紅霉素和阿奇霉素耐藥，二者M IC50和 M IC90均＞128 m g/L。僅14株（12.5%）對紅霉素敏感，M IC均≤0.06 m g/L。

受試的四環素類對肺炎支原體均具有強大的體外抗微生物活性。四環素和多西環素的M IC50和M IC90分別為0.06 m g/L和0.125 m g/L。受試的氟喹諾酮類對肺炎支原體亦具有良好的體外抗微生物活性。相比較 而言，莫西 沙星 M IC50和 M IC90均為0.06 m g/L，明顯優于左氧氟沙星，后者的M IC50和 M IC90均為0.5 m g/L，見表1。

2.3 肺炎支原體核糖體23S rR N A序列分析

98株判定為大環內酯類耐藥的肺炎支原體均存在23S rR N A的核苷酸點突變，97株為 A2063 G突變，1株為 A2064 G突變。14株敏感株均不存在23S rR N A點突變。

表1 6種抗菌藥物對112株肺炎支原體臨床分離株的體外抗微生物活性Table 1 In vitroactivity of 6 antimicrobial agents against 112M.pneu moniaestrains（M IC：m g/L）

3 討論

肺炎支原體臨床株分離培養周期長，技術要求高，臨床上不作為常規檢測開展。近年來由于其對大環內酯類耐藥率不斷上升，因此需要進行培養以獲得更多藥效學數據。利用肺炎支原體生化特性（分解葡萄糖產酸，SP4液體培養基p H 值下降使含酚紅的培養基變為黃色）以及SP4固體培養基見典型菌落（煎蛋樣）可以初步確定菌種。但發酵支原體（M ycoplasm a fermentans）亦可引起呼吸道感染且存在上述生化特性及類似菌落形態［3］，因此在分離獲得純化菌株后，仍需通過P C R方法以確認。目前肺炎支原體肺炎檢測的引物設計多針對16S rR N A、P1黏附蛋白編碼基因和A T P酶操縱子［1］。P1蛋白是一種胰蛋白酶敏感的大分子表面蛋白，是肺炎支原體的特異性黏附因子。本研究采用針對P1基因的引物進行鑒定，證實所分離的臨床分離株均為肺炎支原體。

2011年10月C LSI頒布了支原體藥敏試驗的標準化方法，同時制定了臨床常用治療肺炎支原體抗菌藥物的建議耐藥折點［4］。大環內酯類中紅霉素和阿奇霉素 M IC≤0.5 m g/L 判定為敏感，＞1 m g/L判斷為耐藥（一般耐藥株M IC≥16 m g/L）。這是首次正式提出肺炎支原體對大環內酯類藥物的耐藥折點。該指南同時指出該耐藥折點是參考大環內酯類抗生素對于其他革蘭陽性菌已建立的耐藥折點而制定，是探索性的，將會根據收集到新的相關數據隨時更新。這些不斷更新的數據資料包括檢測菌株是否存在已知的、明確的耐藥機制，M IC值升高是否影響藥物抗微生物活性、藥動學和藥效學特性，菌株的M IC值與臨床預后的相關性等多個因素。目前最根本的工作是收集更多的臨床分離株，根據標準化流程進行藥敏測定，以得到更多的M IC值分布數據，從而進一步明確耐藥折點。

本研究根據已頒布的C LSI標準化藥敏操作規程進行肺炎支原體藥敏試驗，并同時檢測了臨床耐藥株是否存在核糖體23S rR N A核苷酸點突變。結果顯示，2009—2011年分離的肺炎支原體對常用大環內酯類仍保持極高的耐藥率（87.5%），與2005—2008年結果相仿［7］。

肺炎支原體對大環內酯類耐藥主要與靶位改變有關，其耐藥機制主要為核糖體23S rR N A V區中心環核苷酸序列改變（2063位A→G，2064位A→G），導致抗菌藥物與核糖體親和力下降而引起耐藥。本 組 資 料 顯 示，耐 藥 株 均 存在核糖 體 23S rR N A核苷酸點突變，敏感株則不存在上述突變，突變位點明顯集中于 A2063 G位點（99.0%，97/98）。

目前認為對大環內酯類耐藥肺炎支原體的出現和流行始于2000年，以東亞（日本和中國）為主要流行地區，耐藥率逐年上升。日本地區在2000年以前未報道過 對 大環內 酯 類耐 藥 的肺炎 支 原 體［8］，而2000—2010年報道的兒童患者中肺炎支原體對大環內酯類耐藥率為13%～70%，成人患者中分離的肺炎支原體耐 藥率僅 6%［9-14］。中 國報 道的 耐 藥率最高，部分地區兒童患者臨床分離株的耐藥率超過90%（83% ～92%），成人 菌 株 耐 藥 率69%［6-7，15-18］。此外，肺炎支原體對大環內酯類耐藥率超過20%的國家還包括韓國（兒童，31.4%）［19］、以色列（兒童和成人，30%）［20］、意大 利（兒 童，26%）［21］以及 美 國的一項流行的報道，耐藥率為27%（3/11）［22］。本研究結果顯示，目前兒童患者呼吸道分離肺炎支原體對大環內酯類耐藥率高，臨床疑似肺炎支原體感染的兒童患者在初始治療時需要考慮大環內酯類耐藥株感染的可能。

由于諸多可能發生的不良反應，兒童患者選用四環素類及氟喹諾酮類藥物受到極大限制。臨床研究顯示，阿奇霉素治療大環內酯類耐藥肺炎支原體仍可獲得臨床治愈，僅發熱和退熱時間延長［16］。原因可能與阿奇霉素在細胞內濃度較高以及存在免疫調節作用有關。因此，目前肺炎支原體感染患兒，無論是否為耐藥株感染，仍推薦首先選用阿奇霉素治療。但值得關注的是，本研究中阿奇霉素M IC值有上升趨勢（2005—2008年資料 M IC90為64 m g/L）。國外目前研究開發的新酮內酯類藥物如solithro m ycin，對大環內酯類耐藥肺炎支原體具有良好的抗微生物活性［23］，但仍需進一步研究以明確臨床療效。

綜上所述，本研究根據 C LSI新頒布的標準化操作規程來進行肺炎支原體藥物敏感性試驗。結果顯示，兒童患者中分離的肺炎支原體對大環內酯類耐藥率仍保持極高水平，耐藥株均存在核糖體23S rR N A A2063 G或 A2064 G核苷酸點突變。應考慮開發新型抗微生物藥物用于臨床治療大環內酯類耐藥肺炎支原體感染的兒童患者。

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Antimicrobial susceptibility of theM ycoplasma pneumoniaestrains isolated from pediatric patients

Z H A N G H ong，Y EXinyu，X UXiaogang，W A N GMinggui，LIU Yang. （Shanghai Children′s H ospital，Shanghai JiaoTong U niversity，Shanghai 200040，China）

Objective To investigate the profile of antimicrobial susceptibility of theM ycoplasm a pneu moniae （M pn）strains isolated fro m pediatric patients with respiratory tract infection.M ethods A ntimicrobial susceptibility testing was conducted with a total of 112 M pn clinical strains by broth microdilution method.Sequence analysis of full 23S rR N A genes was performed for all M pn strains.Results O ne hundred and twelve M pn strains were isolated fro m January 2009 to M arch 2011. Of these clinicalisolates，98（87.5%）were resistant to erythro m ycin and azithro m ycin.All macrolide-resistant M pn strains harbored an A2063 G or A2064 G transition m utation in do main V of 23S rR N A genes.M pn isolates were still very susceptible to the tetracyclines and fluoroquinolones tested.Conclusions The M pn strains fro m pediatric patients are highly resistant to macrolides.The mechanism of macrolide resistance may be associated withthe transition m utation on 23S rR N A gene.

M ycoplasm a pneu moniae；macrolide；tetracyclines；quinolones；antimicrobial resistance

R375.2

A

1009-7708（2015）01-0063-04

2014-08-22

2014-10-29

國家自然科學基金（81370047）；上海衛生局（20124026）。

1.上海市兒童醫院，上海交通大學附屬兒童醫院檢驗科，上海 200040；2.復旦大學附屬華山醫院。

張泓（1963—），女，碩士，主任技師，主要從事細菌耐藥機制研究。

劉楊，E-mail：liuyang@fudan.edu.cn。