腦缺血再灌注損傷后BMSCs不同示蹤方式的比較

王艷，閔鶴鳴，張苗苗，包翠芬，閔連秋△

腦缺血再灌注損傷后BMSCs不同示蹤方式的比較

王艷1，閔鶴鳴2，張苗苗3，包翠芬4，閔連秋1△

目的比較腦缺血再灌注損傷后，不同示蹤方式觀察骨髓間充質干細胞（BMSCs）移植后的效果。方法BMSCs復蘇培養后，分別采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）、PKH26進行標記，并且與綠色熒光蛋白（GFP）轉染細胞，分別對腦缺血再灌注模型大鼠腦組織進行移植。將75只SPF級雄性SD大鼠隨機均分為假手術組，模型組，BrdU、PKH26、GFP示蹤組。采用線栓改良法制備大鼠左側大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注損傷模型。腦缺血再灌注24 h后，假手術組、模型組分別采用腦立體定位儀經腦實質植入10 μL生理鹽水；BrdU、PKH26、GFP示蹤組分別植入10 μL的BMSCs/BrdU、BMSCs/PKH26、BMSCs/GFP。采用神經行為學評分、TTC染色、腦組織含水量法進行模型鑒定及療效判定，采用焦油紫染色進行神經元計數，并在熒光顯微鏡下計數標記細胞陽性率。結果移植前細胞BrdU、PKH26、GFP標記率無明顯差異。移植4周后3示蹤組大鼠神經行為學評分、腦梗死體積、腦組織含水量均顯著低于模型組，神經元計數顯著高于模型組；神經行為學評分、腦梗死體積高于假手術組，腦組織含水量、神經元計數與假手術組差異無統計學意義；3示蹤組間上述指標差異均無統計學意義。GFP示蹤組的熒光標記細胞陽性率高于BrdU、PKH26示蹤組。結論腦缺血再灌注損傷中，GFP示蹤方式效果更為持久，優于BrdU和PKH26。

再灌注損傷；間質干細胞移植；綠色熒光蛋白質類；熒光抗體技術；腦缺血再灌注；骨髓間充質干細胞；示蹤

缺血性腦血管病的發病率和死亡率均較高，治療后幸存者中約半數以上會遺留不同程度的偏癱和失語癥狀，給個人、家庭和社會帶來了沉重負擔［1］。研究證實，腦缺血后會導致不同程度的細胞死亡，而目前的治療方式多以溶栓、抗凝等對癥治療為主，并不能使壞死的神經元再生，不能從根本上解決缺血性腦中風致殘、致死的問題。為此，許多學者嘗試采用干細胞移植來解決這一問題，為了更好地觀察干細胞移植后在體內的生長、分化等情況，研究人員將干細胞標記后進行移植示蹤觀察［2-3］。目前常用的標記方式多采用熒光染料或細胞轉染的方式，但是何種標記方式更有利于對移植細胞的觀察，且不影響移植細胞的治療效果，目前尚不明確。本實驗擬采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxy Uridine，BrdU）、PKH26、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）3種不同的方式標記骨髓間充質干細胞（BMSCs）并移植，比較BMSCs 3種示蹤方式的移植效果，為細胞移植技術的開展及腦缺血疾病的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級雄性SD大鼠75只，體質量250～300 g，購于遼寧長生生物技術有限公司（許可證號SCXK［遼］2010-0001）；SD大鼠BMSCs（貨號RASMX-01001）、BMSCs/GFP（貨號RASMX-01101）、BMSCs完全培養基（貨號RASMX-90011）、胰酶（貨號TEDTA-10001-100）均購自美國Cyagen Biosciences公司；BrdU、PKH26、稀釋緩沖液C、TTC（Sigma公司）；兔抗大鼠BrdU單克隆抗體（Abcam公司）；FITC標記IgG（北京中杉公司）；Hoechest33258染色試劑盒（碧云天公司）。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs、GFP轉染的BMSCs（BMSCs/GFP）的復蘇與培養分別將凍存的BMSCs、BMSCs/GFP復蘇后，按（2.0～4.0）× 104/cm2的密度接種到25 mL的培養瓶中，加入完全培養基，置于37℃、5%CO2、80%相對濕度的培養箱中培養。隔日換液直到細胞達80%～90%的匯合度，經胰酶消化后進行傳代［4］。

1.2.2 BMSCs的BrdU標記與移植（1）BMSCs的BrdU標記。待培養瓶內的P4代BMSCs達80%～90%的匯合度時，取部分細胞用胰酶消化后將其接種于6孔培養板（內置經滅菌處理后的蓋玻片），加入完全培養基，置于37℃、5%CO2、80%相對濕度的培養箱中培養，待細胞達80%的匯合度時，加入2 μmol/L BrdU，置培養箱中孵育72 h［5］，待細胞達80%～90%的匯合度時，棄去培養液，PBS洗滌3次。采用甲醇/醋酸固定10 min左右。略干燥后，0.3%H2O2-甲醇液浸泡30 min左右以滅活內源性過氧化物酶。用5%正常血清封閉，加入1∶100稀釋的兔抗大鼠BrdU單克隆抗體（陰性對照加同源血清替代單抗）4℃孵育過夜。次日取出漂洗后，加入FITC標記的羊抗兔IgG 37℃孵育30 min，PBS漂洗。采用Hoechest33258復染核5～10 min，PBS漂洗。熒光顯微鏡下隨機計數10個高倍視野中BrdU陽性細胞數（呈綠色熒光），計算陽性細胞數占細胞總數的百分比（即細胞BrdU標記率）。（2）BMSCs/BrdU的移植。待培養瓶內的P4代BMSCs達80%的匯合度時，向培養瓶內加入5 μmol/L BrdU，置培養箱中孵育72 h，胰酶消化并用完全培養基重懸后用于細胞移植（移植細胞濃度約為5.0×106/mL）。

1.2.3 BMSCs的PKH26標記與移植待培養瓶內的P4代BMSCs達80%～90%的匯合度時，胰酶消化制成含有2×107BMSCs的細胞懸液，用無血清的培養基洗滌離心后，將細胞團重懸于1 mL的稀釋緩沖液C中，后將細胞懸液混于含有4×10-6mol/L PKH26染液的1 mL稀釋緩沖液C中，室溫條件下孵育5 min，加入2 mL胎牛血清終止反應，完全培養基清洗細胞3次以去除未結合染料，最后加入4 mL完全培養基重懸細胞至移植所需濃度。將少量PKH26標記過的BMSCs接種于6孔培養板（內置經滅菌處理后的蓋玻片）中，加入完全培養基，置于37℃、5%CO2、80%相對濕度的培養箱中培養［6］。待細胞達80%～90%的匯合度時，采用Hoechest 33258復染核5～10 min，PBS漂洗。熒光顯微鏡下隨機計數10個高倍視野中PKH26陽性細胞數（呈紅色熒光），計算陽性細胞數占細胞總數的百分比（即細胞PKH26標記率）。而其余PKH26標記過的BMSCs用于細胞移植（移植細胞濃度約為5.0×106/mL）。

1.2.4 BMSCs/GFP的標記與移植待培養瓶內的P4代BMSCs/GFP達80%～90%的匯合度時，胰酶消化后用完全培養基重懸制成BMSCs/GFP懸液，小部分的BMSCs/GFP懸液接種于6孔培養板（內置經滅菌處理后的蓋玻片），加入完全培養基，置于37℃、5%CO2、80%相對濕度的培養箱中培養，待細胞達80%～90%的匯合度時，棄去培養液，采用Hoechest33258復染核5～10 min，PBS漂洗。熒光顯微鏡下隨機計數10個高倍視野中GFP陽性細胞數（呈綠色熒光），計算陽性細胞數占細胞總數的百分比（即細胞GFP標記率）。大部分的BMSCs/GFP懸液用于移植（移植細胞濃度約為5.0×106/mL）。

1.2.5 實驗分組及治療方法采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組、模型組、BrdU示蹤組、PKH26示蹤組、GFP示蹤組，每組15只。采用Longa等［7］的線栓改良法制備大鼠左側大腦中動脈阻斷局灶性腦缺血再灌注損傷模型。線栓采用頭端光滑燙圓直徑為0.265 mm的魚線，由左側頸總動脈分叉處緩慢向頸內動脈顱內方向插入約（18.5±0.5）mm，使線頭通過大腦中動脈起始處以阻斷其血流；假手術組魚線插入深度＜15 mm。阻塞2 h后，輕輕拔出魚線即為再灌注。腦缺血再灌注24 h后，假手術組、模型組分別采用腦立體定位儀經腦實質植入10 μL生理鹽水［8］；BrdU示蹤組、PKH26示蹤組、GFP示蹤組分別采用腦立體定位儀經腦實質植入10 μL的BMSCs/BrdU、BMSCs/PKH26、BMSCs/GFP（生理鹽水和3種示蹤細胞的植入部位均為旁開2.0 mm，前囟后4.3 mm，深度2.6 mm；移植細胞濃度約為5.0×106/mL）［9］。

1.2.6 神經行為學評分分別于腦缺血再灌注后24 h、1周、2周、4周時，采用改良神經功能缺損評分（modified neurological severity scores，mNSS）［1］對各組動物進行神經行為學評分，

進行模型鑒定及療效判定。神經功能分級范圍為0～18（正常評分為0，最大缺陷評分為18，分數越高，意味著缺損越重）［10-11］。對于實驗過程中剔除的大鼠按照嚴格的實驗條件進行補充。

1.2.7 腦組織含水量檢測于腦缺血再灌注4周時，每組各取5只大鼠，快速斷頭取出左側大腦組織，采用干濕重法，稱質量后于恒溫干燥箱（60℃）干燥至恒重（約6 h），再稱質量。腦組織含水量（%）=（濕質量-干質量）/濕質量×100%。

1.2.8 TTC染色計算腦梗死體積于腦缺血再灌注4周后，每組各取5只大鼠，分別對各組進行TTC染色，以觀察各組的治療情況。10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉，快速斷頭取腦，生理鹽水沖洗后置入-20℃冰箱中冷凍10～30 min后取出，在冰盤上迅速去除小腦和低位腦干、嗅球，大腦冠狀切片（每個腦組織平均切成6片），將腦片置于新鮮配制的2% TTC染液缸中，37℃避光孵育30 min，間隔5 min輕輕搖晃1次，使其均勻染色（梗死區腦組織呈白色，正常腦組織呈紅色）。生理鹽水沖洗，10%福爾馬林固定，數碼相機照相，利用CIAS-1000型圖像分析系統測量并計算大腦組織梗死區體積占同側大腦半球體積的百分比。

1.2.9 神經元計數大鼠腦缺血再灌注4周后，每組各取5只大鼠，先后行生理鹽水、4%多聚甲醛灌流后快速斷頭取腦，在前囟后2.6～4.6 mm間冠狀切取腦組織，后固定于10%福爾馬林中。經20%蔗糖去除水份后，進行冰凍切片，焦油紫染色，經梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，每只大鼠隨機取3個不同視野，每組共計15個視野，熒光顯微鏡下隨機計數15個高倍視野中正常神經元數量。

1.2.10 熒光標記細胞陽性率取示蹤組腦組織，行冰凍切片，BrdU示蹤組余下操作同1.2.2。PKH26示蹤組、GFP示蹤組行冰凍切片后，采用Hoechest33258復染核5～10 min，PBS漂洗。熒光顯微鏡下隨機計數15個高倍視野中BrdU、PKH26、GFP標記細胞陽性率。

1.3 統計學方法數據分析應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料均以均值±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，組間多重比較采用LSD（方差齊）或Tamhane′s T2（方差不齊）法比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞復蘇培養后的形態觀察相差顯微鏡下可見BMSCs及BMSCs/GFP細胞經復蘇后呈貼壁生長，生長速度較快，細胞排列緊密，細胞形態、大小均一；且BMSCs/GFP細胞于熒光顯微鏡下可見細胞內有明顯的綠色熒光，見圖1。

2.2 細胞標記率比較細胞BrdU、PKH26、GFP標記率分別為（92.7±4.9）%、（93.4±4.6）%、（94.9± 3.3）%，3種標記率差異無統計學意義（F=0.686，P＞0.05），見圖2。

2.3 各組大鼠神經行為學評分結果假手術組大鼠未見神經功能缺損癥狀，其余各組于腦缺血再灌注24 h后均出現明顯的神經功能缺損癥狀，隨著時間的延長，神經功能缺損癥狀逐漸減輕。3示蹤組于腦缺血再灌注后1周、2周、4周時mNSS均低于模型組（均P＜0.05），24 h時與模型組差異無統計學意義；腦缺血再灌注后不同時點3示蹤組mNSS間差異均無統計學意義。組間和處理時間之間存在交互效應。見表1。

Fjg.1Morphology of BMSCs andBMSCs/GFP圖1 BMSCs、BMSCs/GFP的形態觀察

Fig.2Comparison of cell labeled efficacy between three tracing groups圖2 3示蹤組細胞標記率的比較

Tab.1Comparison of neural behavioral score between all groups at different time points表1 各組不同時點mNSS的比較（n=15，分，）

Tab.1Comparison of neural behavioral score between all groups at different time points表1 各組不同時點mNSS的比較（n=15，分，）

＊P＜0.05；F組間=455.324，F時間=208.551，F交互=17.658，均P＜0.05；a與假手術組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別假手術組模型組B r d U示蹤組P K H 2 6示蹤組G F P示蹤組F 2 4 h 0 1 3 . 3 3 ± 2 . 4 4 a 1 4 . 0 0 ± 1 . 9 6 a 1 2 . 2 7 ± 1 . 9 8 a 1 1 . 2 0 ± 1 . 7 4 a 1 4 9 . 4 0 2＊1周0 1 0 . 3 3 ± 1 . 8 0 a 7 . 3 3 ± 0 . 9 8 a b 7 . 3 3 ± 1 . 2 3 a b 7 . 4 0 ± 1 . 3 5 a b 1 4 7 . 0 1 3＊2周0 9 . 4 7 ± 1 . 3 6 a 5 . 9 3 ± 1 . 3 4 a b 6 . 0 0 ± 1 . 2 0 a b 6 . 0 0 ± 1 . 1 3 a b 1 3 8 . 1 6 8＊4周0 8 . 8 0 ± 1 . 7 4 a 5 . 0 0 ± 1 . 5 1 a b 5 . 3 3 ± 1 . 3 5 a b 5 . 7 3 ± 1 . 4 9 a b 8 0 . 5 2 9＊F -1 7 . 0 9 1＊1 1 1 . 9 8 0＊6 7 . 8 7 1＊4 5 . 6 0 0＊

2.4 各組大鼠腦組織含水量比較各組大鼠腦組織含水量差異有統計學意義（n=5，F=16.604，P＜0.05）。BrdU示蹤組（76.89±1.65）%、PKH26示蹤組（77.20±0.68）%和GFP示蹤組（77.34±1.80）%均低于模型組（83.93±2.44）%，與假手術組（77.56±1.07）%差異無統計學意義；3示蹤組間差異均無統計學意義。

2.5 各組大鼠腦梗死體積比較假手術組大鼠未見梗死灶，呈明顯的紅色；模型組可見明顯的蒼白色梗死灶，3示蹤組僅見極少量缺血區域，見圖3。各組腦梗死體積差異有統計學意義（n=5，F=410.160，P＜0.05），BrdU示蹤組（3.06±0.57）%、PKH26示蹤組（3.53±0.56）%、GFP示蹤組（3.39±0.45）%均高于假手術組（0），明顯低于模型組（33.45±3.31）%；3示蹤組間差異均無統計學意義。

2.6 各組大鼠神經元計數比較假手術組皮質可見正常的腦組織形態結構，模型組正常神經元數量顯著減少，可見大量壞死神經元，3示蹤組可見少量的壞死神經元，見圖4。各組正常神經元數量差異有統計學意義（n=15，F=62.810，P＜0.05），BrdU示蹤組（72.73±8.47）個、PKH26示蹤組（74.87±6.97）個、GFP示蹤組（76.40±7.67）個均高于模型組（44.20±6.96）個，與假手術組（78.00±3.30）個差異無統計學意義；3示蹤組間差異均無統計學意義。

2.7 各組大鼠熒光標記細胞陽性率比較假手術組和模型組熒光顯微鏡下未見熒光標記細胞，3示蹤組均可見移植的熒光標記細胞，見圖5。GFP示蹤組熒光標記細胞陽性率（29.60±6.53）%高于BrdU示蹤組（21.08±6.68）%和PKH26示蹤組（21.64±3.82）%，差異有統計學意義（F=136.829，P＜0.05），BrdU示蹤組與PKH26示蹤組間差異無統計學意義。

Fig.3Comparison of brain infarct volume between all five groups圖3 各組腦梗死體積比較

Fig.4Comparison of neuron counts between all five groups圖4 各組神經元計數比較

Fig.5Comparison of rate of cells labeled by fluorescence between all five groups圖5 各組熒光標記細胞陽性率的比較

3 討論

目前研究顯示，對于干細胞的示蹤方式主要有同位素、抗原標記法（如BrdU標記）、熒光染料（如PKH26）、熒光蛋白（如GFP標記）示蹤等方法。其中因同位素的放射性污染問題，目前已較為少用。

BrdU屬于胸腺嘧啶核苷的類似物，當細胞處于DNA合成期，BrdU就會摻入到新合成的DNA中，利用這個原理可以對細胞進行標記，經免疫組織化學染色可觀察到BrdU在細胞核內的褐色沉淀。

PKH26是一種具有親脂性的紅色熒光染料，能夠和細胞膜的脂質雙層區域進行穩定的結合。GFP轉染是利用腺病毒載體將GFP蛋白導入BMSCs。GFP性質穩定，不需任何因子的協助就能被激發產生熒光，對細胞和機體毒性小。

本實驗采用3種不同方式對移植細胞進行標記，移植前檢測了BrdU、PKH26、GFP 3種類型細胞的標記率，結果顯示三者之間差異無統計學意義；移植后監測了大鼠神經功能缺損情況，發現于缺血再灌注模型24 h后，除假手術組外的大鼠均出現明顯的神經功能缺損癥狀，提示模型制備成功。隨著時間的延長，各組大鼠神經功能缺損癥狀均有所減輕，至移植4周后3個示蹤組大鼠神經功能評分、腦梗死體積、腦含水量均顯著低于模型組，正常神經元計數顯著高于模型組，且3組之間差異無統計學意義，提示3組不同標記方式的細胞移植后對治療效果無顯著影響。但熒光顯微鏡下觀察到GFP示蹤組損傷區域的移植細胞顯著高于BrdU、PKH26示蹤組，提示GFP轉染后細胞移植的標記效果更為穩定持久，且熒光亮度基本不衰減，是最為有效的細胞示蹤方式。

本實驗中BrdU的檢測細胞數量低于GFP轉染，筆者推測有如下原因：（1）可能是由于BrdU片段干擾DNA雙螺旋結構的穩定性，引起細胞死亡［12-13］，從而影響Hoechest等染色，導致染色彌散，準確性降低。（2）前期有研究證實BrdU標記后會隨著細胞的增殖和分裂而丟失，從而導致標記強度的減弱。（3）若標記細胞死亡后，BrdU會從死亡細胞釋放出來，易被附近的細胞所攝取，使該細胞內出現BrdU陽性表達，即假陽性標記［5］。上述原因可能是導致BrdU標記不能準確反映真實的細胞標記率的因素。PKH26可以在不影響細胞增殖和分化的情況下保持在細胞上，但在經過進一步的染色處理后，如原位雜交和免疫染色，會使其標記熒光消退，降低對標記細胞示蹤的示蹤效果，從而影響細胞標記率的檢測［14-15］。Li等［6］研究證明移植入體內的PKH26標記的少量細胞受病變處微環境的影響而發生裂解，其碎片可以將PKH26染料轉移到宿主體內的其他細胞，從而出現假陽性標記，導致PKH26標記不能準確反映真實的細胞標記率。這些可能是本實驗中導致BrdU和PKH26移植細胞數量少于GFP轉染細胞或者是細胞標記位置改變的主要原因。

［1］Prabhakaran S，Ruff I，Bernstein RA.Acute stroke intervention:a systematic review［J］.JAMA，2015，313（14）:1451-1462.doi:10.1001/ jama.2015.3058.

［2］Kuroda S，Houkin K.Translational challenge for bone marrow stroma cell therapy after stroke［J］.Front Neurol Neurosci，2013，32:62-68.doi:10.1159/000346414.

［3］Liu N，Deguchi K，Yamashita T，et al.Intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells ameliorates tissue plasminogen activator-induced brain damage after cerebral ischemia in mice detected by in vivo and ex vivo optical imaging［J］.J Neurosci Res，2012，90（11）:2086-2093.doi:10.1002/jnr.23104.

［4］Kuroda S.Bone marrow stromal cell transplantation for ischemic stroke--its multi-functional feature［J］.Acta Neurobiol Exp（Wars），2013，73（1）:57-65.

［5］Coyne TM，Marcus AJ，Woodbury D，et al.Marrow stromal cells transplanted to the adult brain are rejected by an inflammatory response and transfer donor labels to host neurons and glia［J］.Stem Cells，2006，24（11）:2483-2492.

［6］Li P，Zhang R，Sun H，et al.PKH26 can transfer to host cells in vitro and vivo［J］.Stem Cells Dev，2013，22（2）:340-344.doi:10.1089/ scd.2012.0357.

［7］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）:84-91.

［8］Yu Y，Liu XZ，Bao CF，et al.Effects of ginsenoside Rg1 on PARP-1 and TNFR1 expression in rat model of focal cerebral ischemia［J］. Tianjin Med J，2015，43（3）:245-248.［于洋，劉學政，包翠芬，等.人參皂苷Rg1對局灶性腦缺血大鼠PARP-1和TNFR1表達的影響［J］.天津醫藥，2015，43（3）:245-248］.doi:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.006.

［9］Wang Y，Fu W，Zhang S，et al.CXCR-7 receptor promotes SDF-1α-induced migration of bone marrow mesenchymal stem cells in the transientcerebral ischemia/reperfusion rat hippocampus［J］.Brain Res，2014，1575:78-86.doi:10.1016/j.brainres.2014.05.035.

［10］Lee YS，Chio CC，Chang CP，et al.Long course hyperbaric oxygen stimulates neurogenesis and attenuates inflammation after ischemic stroke［J］.Mediators Inflamm，2013，2013:512978.doi:10.1155/2013/ 512978.

［11］Chen J，Sanberg PR，Li Y，et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats［J］.Stroke，2001，32（11）:2682-2688.

［12］Almeida JC，Sauaia H，Viana JC.5-Bromo-2′-deoxyuridine induces visible morphological alteration in the DNA puffs of the anterior salivary gland region of bradysia hygida（Diptera，Sciaridae）［J］.Braz J Medical Biol Res，2010，43（12）:1143-1152.

［13］Schneider L，d′Adda di Fagagna F.Neural stem cells exposed to BrdU lose their global DNA methylation and undergo astrocytic differentiation［J］.Nucleic Acids Res，2012，40（12）:5332-5342.

［14］Goncalves MA，de Vries AA，Holkers M，et al.Human mesenchymal stem cells ectopically expressing full-length dystrophin can complement Duchenne muscular dystroph myotubes by cell fusion［J］.Hum Mol Gene，2006，15（2）:213-221.

［15］Chen J，Wang C，Lu S，et al.In vivo chondrogenesis of adult bone marrow derived autologous mesenchymal stem cells［J］.Cell Tissue Res，2005，319（3）:429-438.

（2015-06-05收稿 2015-09-01修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Comparison of different ways to trace BMSCs after cerebral ischemia-reperfusion injury

WANG Yan1，MIN Heming2，ZHANG Miaomiao3，BAO Cuifen4，MIN Lianqiu1△
1 Department of Neurology，First Affiliated Hospital of Jinzhou City，Jinzhou，Liaoning 121001，China；2 Department of Cell Biology，3 Department of Anatomy，4 Key lab of Molecular Cell Biology and New Drug Development，Liaoning Medical University△

ObjectiveTo compare different ways to trace bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）after being transplanted in cerebral ischemia-reperfusion injury.MethodsMale SD rats of SPF grade were randomly divided into sham group，model group（ischemia-reperfusion，IR），BrdU tracing group，PKH26 tracing group and GFP tracing group.Focal cerebral ischemia-reperfusion model was established by blocking middle cerebral artery.24 hours after cerebral ischemia-reperfusion injury，10 μL BMSCs that were labeled respectively by BrdU，PKH26，GFP were added respectively into BrdU，PKH26 and GFP tracing group while equal volum of normal saline was added into sham group and model group.Model and transplanting cells efficacy was determined by neural behavioral score，TTC staining and brain water content；Neurons were counted using tar violet staining；The number of transplant cells in the transplanting site was assessed by fluorescence microscopy.ResultsBefore transplanting，there was no significant difference among BrdU，PKH26 and GFP group in cell labeled efficacy.By contrast，neural behavioral score，brain infarct volume and brain tissue water content were significantly lower in all three tracing groups than that in model group 4 weeks after transplantation while neuron counts were markedly higher.There was no significant difference of above parameters among the three tracing groups.However，the number of traced transplanting cells in damaging area in GFP group is significantly higher than that in BrdU group and PKH26 group. ConclusionIn cerebral ischemia-reperfusion injury，the tracing effect of GFP last longer，therefore it is significantly more effective than BrdU and PKH26.

reperfusion injury；mesenchymal stem cell transplantation；green fluorescent proteins；fluorescent antibody technique；cerebral ischemia-reperfusion；bone marrow mesenchymal stem cells；trace

R743.31

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.009

國家自然科學基金項目（81202783，31170930）

1遼寧醫學院附屬第一醫院神經內科（郵編121001），2細胞生物學教研室，3解剖學教研室，4省高校分子生物與新藥開發重點實驗室

王艷（1988），女，碩士研究生，主要從事腦血管疾病防治研究

△通訊作者E-mail：mianyizuhua@aliyun.com