異甘草素對胃癌SGC7901細(xì)胞侵襲能力的影響

劉方康，牛瓊，王愛麗，賈興芳，胡營濱，劉成霞

異甘草素對胃癌SGC7901細(xì)胞侵襲能力的影響

劉方康，牛瓊，王愛麗，賈興芳，胡營濱，劉成霞△

目的探討異甘草素（isoliquiritigenin）對人胃癌SGC7901細(xì)胞侵襲能力的影響及其可能的分子機(jī)制。方法取對數(shù)生長期人胃癌SGC7901細(xì)胞，分為對照組（正常細(xì)胞培養(yǎng)液），異甘草素實(shí)驗(yàn)組（異甘草素溶于細(xì)胞培養(yǎng)液，濃度分別為10、25、50、100 μmol/L），每組4個復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72 h后采用MTT法檢測異甘草素對細(xì)胞生長的抑制情況，摸索后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度和作用時間；采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的侵襲能力；Western blotting法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、蛋白激酶B（Akt）和磷酸化Akt（P-Akt）的表達(dá)。結(jié)果10 μmol/L異甘草素不能抑制胃癌細(xì)胞株SGC7901的生長，而25、50、100 μmol/L異甘草素可明顯抑制其生長，且呈時間和濃度依賴性，24、48、72 h半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為52.48、44.49、32.50 μmol/L，故選定后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度為25、50、100 μmol/L，作用時間為24 h。與對照組穿膜細(xì)胞數(shù)（個：209.75±9.29）相比，25 μmol/L組（138.50±10.15）、50 μmol/L組（89.50± 16.56）、100 μmol/L組（45.00±8.08）逐漸降低（F=267.948，P＜0.05）。各組間Akt蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F= 1.492）；隨異甘草素濃度的增加，P-Akt、MMP-9蛋白水平逐漸降低（F分別為359.219、431.324，均P＜0.05）。結(jié)論異甘草素能夠抑制SGC7901細(xì)胞侵襲能力，其機(jī)制可能與下調(diào)PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白及其下游的MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)。

甘草；胃腫瘤；基質(zhì)金屬蛋白酶9；異甘草素；侵襲；PI3K/Akt；蛋白激酶B；磷酸化蛋白激酶B

胃癌是源自于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在我國和世界范圍均較高［1］。侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)行為之一，也是影響腫瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。近年來腫瘤的診斷技術(shù)取得較大進(jìn)步，但胃癌的總體治療效果仍不盡人意。普通的化學(xué)抗腫瘤藥物毒副作用較大，在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時，對正常機(jī)體細(xì)胞也有很大的損傷，因此開發(fā)低毒的天然抗腫瘤藥物成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。異甘草素（isoliquiritigenin）是從甘草的根部提取的一種黃酮類成分，屬于羥基查耳酮類化合物。有研究表明異甘草素具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥、增加血管彈性、抑制脂質(zhì)過氧化等生物活性［2］，其中抗腫瘤作用在近年來備受關(guān)注。研究顯示，異甘草素對多種腫瘤細(xì)胞（肺癌、前列腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、宮頸癌等）均呈現(xiàn)細(xì)胞毒性［3-4］，但這些研究多集中在異甘草素對細(xì)胞增殖和凋亡方面的作用，尚少見其對腫瘤細(xì)胞侵襲能力影響的相關(guān)研究。本研究旨在探討異甘草素對人胃癌SGC7901細(xì)胞的侵襲抑制作用及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料人胃癌細(xì)胞系SGC7901（武漢博士德公司），異甘草素（含量≥98%，大連美侖生物技術(shù)有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、胎牛血清（美國Thermo公司），0.25%胰蛋白酶、細(xì)胞裂解液（Solarbio公司，中國），噻唑藍(lán)（MTT，Pro?mega公司，美國），Transwell小室（Corning公司，美國），基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）抗體（一抗）、蛋白激酶B（Akt）抗體和磷酸化蛋白激酶B（P-Akt）抗體（一抗）均購自美國abcam公司，辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（二抗）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，內(nèi)參GAPDH購自杭州賢至生物科技有限公司。

1.2 主要儀器CO2培養(yǎng)箱（HERAcell 150i，Thermo Fisher Scientific公司，美國），倒置照相顯微鏡（CK×41SF，Olympus公司，日本），多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax M2，Molecular Devic?es公司，美國），CliNX曝光儀（ChemiScope 3500 Mini，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌SGC7901細(xì)胞以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d用0.25%的胰蛋白酶消化、傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期人胃癌SGC7901細(xì)胞，0.25%胰酶消化，用細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基）制成1×105/mL單細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)12 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組（正常細(xì)胞培養(yǎng)液），異甘草素實(shí)驗(yàn)組（異甘草素溶于細(xì)胞培養(yǎng)液，濃度分別為10、25、50、100 μmol/L），每組4個復(fù)孔。12 h后將對照組換上100 μL新鮮培養(yǎng)液，異甘草素實(shí)驗(yàn)組去除細(xì)胞培養(yǎng)液后換上100 μL相應(yīng)濃度的異甘草素培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，吸去培養(yǎng)液，各孔加入MTT（5 g/L）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去上層液體，加DMSO各120 μL，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀上讀取490 nm處吸光度（A）值。計算細(xì)胞生長抑制率=（A對照-A實(shí)驗(yàn)）/A對照。并用Bliss法計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.3.3 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)在Transwell下室（即24孔板內(nèi)）加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，作為侵襲誘導(dǎo)因子，吸取含105個細(xì)胞體積的細(xì)胞懸液，無血清培養(yǎng)基補(bǔ)足至400 μL，混合均勻，將細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上部小室，將上述Transwell板置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h去除上室，經(jīng)PBS洗滌后，吸盡殘余液體，自然晾干，加24.72 mol/L甲醇固定30 min，然后用0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗去多余的液體，倒置照相顯微鏡觀察計數(shù)。隨機(jī)讀取5個視野，以穿膜細(xì)胞的平均數(shù)來表示被檢測胃癌細(xì)胞的侵襲能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3.4 Western blotting法檢測MMP-9、Akt和P-Akt的表達(dá)收集25、50、100 μmol/L的異甘草素處理的SGC7901細(xì)胞和對照組細(xì)胞，加入100 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，提取總蛋白，采用碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。常規(guī)制膠、上樣，進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，然后轉(zhuǎn)膜，封閉。加入兔抗人Akt（1∶1 000）、兔抗人P-Akt（1∶5 000）、兔抗人MMP-9（1∶1 000），4℃孵育過夜。漂洗過后再分別加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000），于37℃搖床溫育2 h。用CLiNX曝光儀曝光。每個濃度組重復(fù)3次，取平均值。以GAPDH為參照，實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析。計量資料以表示，采用單因素方差分析比較各組間差異，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異甘草素對人胃癌細(xì)胞株SGC7901的生長抑制作用10 μmol/L異甘草素不能抑制胃癌細(xì)胞株SGC7901的生長，而25、50、100 μmol/L異甘草素可明顯抑制胃癌細(xì)胞株SGC7901的生長，隨藥物濃度的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)（均P＜0.05），且生長抑制作用隨作用時間增加而增強(qiáng)，24、48、72 h其IC50值分別為52.48、44.49、32.50 μmol/L，見表1。依據(jù)以上結(jié)果，篩選25、50、100 μmol/L的異甘草素用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，作用時間為24 h。

2.2 甘草素對SGC7901細(xì)胞體外侵襲能力的影響與對照組穿膜細(xì)胞數(shù)（個：209.75±9.29）相比，25 μmol/L組（138.50±10.15）、50 μmol/L組（89.50± 16.56）、100 μmol/L組（45.00±8.08）逐漸降低，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=267.948，n=4，P＜0.05），見圖1。

2.3 異甘草素對Akt、P-Akt、MMP-9蛋白表達(dá)水平

的影響各組間Akt蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比，不同濃度異甘草素可明顯降低SGC7901細(xì)胞P-Akt、MMP-9蛋白表達(dá)水平，且隨藥物濃度的增加，P-Akt、MMP-9蛋白表達(dá)水平逐漸降低，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表2、圖2。

Tab.1The inhibitory effects of isoliquirigenin on growth of human gastric carcinoma SGC7901 cells表1 異甘草素對人胃癌SGC7901細(xì)胞的生長抑制作用（n=4）

Tab.1The inhibitory effects of isoliquirigenin on growth of human gastric carcinoma SGC7901 cells表1 異甘草素對人胃癌SGC7901細(xì)胞的生長抑制作用（n=4）

*P＜0.05；a與對照組比較，b與10 μmol/L組比較，c與25 μmol/L組比較，d與50 μmol/L組比較，P＜0.05

組別對照組1 0 μ m o l / L組2 5 μ m o l / L組5 0 μ m o l / L組1 0 0 μ m o l / L組F 2 4 h 1 . 1 5 6 ± 0 . 0 4 5 1 . 1 2 5 ± 0 . 0 4 7 0 . 7 2 0 ± 0 . 0 2 2 a b 0 . 5 8 0 ± 0 . 0 1 8 a b c 0 . 4 7 0 ± 0 . 0 3 7 a b c d 3 1 4 . 3 5 6 * A（x ˉ ± s）4 8 h 1 . 5 0 9 ± 0 . 0 2 4 1 . 4 5 4 ± 0 . 0 5 2 0 . 8 5 5 ± 0 . 0 4 2 a b 0 . 6 5 1 ± 0 . 0 3 7 a b c 0 . 4 5 7 ± 0 . 0 5 1 a b c d 5 0 5 . 2 8 4 * 7 2 h 0 . 2 5 0 ± 0 . 0 0 7 0 . 2 4 2 ± 0 . 0 1 2 0 . 1 1 1 ± 0 . 0 0 8 a b 0 . 0 7 3 ± 0 . 0 0 6 a b c 0 . 0 3 3 ± 0 . 0 0 2 a b c d 7 7 8 . 3 6 6 *組別對照組1 0 μ m o l / L組2 5 μ m o l / L組5 0 μ m o l / L組1 0 0 μ m o l / L組抑制率2 4 h 4 8 h 7 2 h ------0 . 3 7 8 0 . 4 9 9 0 . 5 9 6 0 . 4 3 4 0 . 5 6 9 0 . 6 9 7 0 . 5 5 6 0 . 7 0 9 0 . 8 5 8

Fig.1In vitro invasive abilities of SGC7901 cells in four groups（crystal violet staining，×400）圖1 各組SGC7901細(xì)胞體外侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×400）

Tab.2The effects of different concentrations of isoliquirigenin on the expressions of Akt，P-Akt，MMP-9 in SGC7901 cells表2 不同濃度異甘草素對SGC7901細(xì)胞Akt、P-Akt、MMP-9表達(dá)的影響（n=3，）

Tab.2The effects of different concentrations of isoliquirigenin on the expressions of Akt，P-Akt，MMP-9 in SGC7901 cells表2 不同濃度異甘草素對SGC7901細(xì)胞Akt、P-Akt、MMP-9表達(dá)的影響（n=3，）

*P＜0.05；a與對照組比較，b與25 μmol/L組比較，c與50 μmol/L組比較，P＜0.05

M M P -9 0 . 5 1 9 ± 0 . 1 9 9 0 . 4 1 3 ± 0 . 0 0 9 a 0 . 2 8 5 ± 0 . 0 0 6 a b 0 . 1 9 8 ± 0 . 0 0 6 a b c 4 3 1 . 3 2 4 *組別對照組2 5 μ m o l / L組5 0 μ m o l / L組1 0 0 μ m o l / L組F A k t 0 . 8 2 3 ± 0 . 0 0 8 0 . 8 4 8 ± 0 . 1 4 5 0 . 8 5 0 ± 0 . 0 0 3 0 . 8 3 8 ± 0 . 3 0 9 1 . 4 9 2 P -A k t 0 . 8 7 9 ± 0 . 1 7 6 0 . 7 5 3 ± 0 . 3 6 3 a 0 . 4 4 8 ± 0 . 2 6 1 a b 0 . 3 0 4 ± 0 . 0 0 7 a b c 3 5 9 . 2 1 9 *

Fig.2The effects of different concentrations of isoliquirigenin on protein expression levels of Akt，P-Akt and MMP-9 of SGC7901 cells圖2 不同濃度異甘草素作用于SGC7901細(xì)胞24 h，AKT、P-Akt、MMP-9蛋白表達(dá)水平的變化

3 討論

我國是胃癌的高發(fā)國家，其病死率居所有惡性腫瘤的第1位［4］，胃癌臨床表現(xiàn)為進(jìn)展快、預(yù)后差，抑制腫瘤的侵襲能力而減少腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是治療腫瘤的關(guān)鍵手段。目前，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，中藥及其有效成份抗腫瘤作用的研究取得很大的進(jìn)展。甘草中的有效成份異甘草素的抗腫瘤作用是近年來研究的熱點(diǎn)。研究表明，異甘草素可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤組織血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬發(fā)生、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化等方式發(fā)揮抗腫瘤作用［5］。Wang等［6］研究發(fā)現(xiàn)，異甘草素通過Wnt配體抑制因子的去甲基化調(diào)控下游的βcatenin蛋白及細(xì)胞周期阻滯，實(shí)現(xiàn)對乳腺癌干細(xì)胞的增殖抑制作用。異甘草素還可以通過抑制花生四烯酸及PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡［7］。Zhou等［8］發(fā)現(xiàn)異甘草素通過上調(diào)p53、p21的蛋白表達(dá)誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞A549凋亡。但是尚少見有關(guān)異甘草素對胃癌細(xì)胞侵襲能力影響及可能機(jī)制的報道。本研究結(jié)果顯示，異甘草素能顯著抑制SGC7901細(xì)胞的增殖，其抑制作用呈濃度和時間依賴性。另外，與對照組相比，25、50、100 μmol/L組SGC7901細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)依次減少，呈濃度依賴性，提示異甘草素能抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的侵襲能力，在25～100 μmol/L的濃

度范圍內(nèi)，藥物濃度越高，其對胃癌細(xì)胞的侵襲能力抑制作用越大。

PI3K/Akt信號通路與肺癌、胃癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等方面發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路與胃癌的發(fā)生、生長以及化療耐藥、放療均有密切關(guān)系［9］。Akt是PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵分子，P-Akt通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)而發(fā)揮作用［10］，且PAkt具有細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位的能力，可定位于細(xì)胞的最便于侵襲的細(xì)胞區(qū)域，便于侵襲的發(fā)生［11］。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多階段、多途徑，涉及多基因變化的一系列復(fù)雜過程，包括細(xì)胞從原發(fā)灶脫落，侵入血管或淋巴管，遷移、黏附于適宜部位，對抗宿主的腫瘤免疫，最終在遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移灶，其中蛋白降解酶對細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤侵襲性的標(biāo)志。MMP-9是一種Zn2+依賴性蛋白酶家族，其主要功能是降解和再塑造細(xì)胞外基質(zhì)。有研究表明，MMP-9能夠降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移，是反映腫瘤侵襲能力的重要指標(biāo)之一［12］。亦有研究證實(shí)，經(jīng)PI3K/Akt途徑，P-Akt能夠使MMP-9產(chǎn)量增加，使胃癌細(xì)胞運(yùn)動能力增強(qiáng)，有助于癌細(xì)胞侵襲［13］。本研究結(jié)果顯示，異甘草素可降低SGC7901細(xì)胞中P-Akt、MMP-9的蛋白表達(dá)水平，提示異甘草素可能通過PI3K/Akt信號途徑下調(diào)侵襲性蛋白MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而抑制了SGC7901細(xì)胞的侵襲能力，這也可能是其抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一。此外，各組間Akt蛋白表達(dá)未見明顯差異，提示甘草素僅對P-Akt的表達(dá)有影響，而對非活化形式的Akt不起作用，與既往研究結(jié)果一致［7］。

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（2015-05-26收稿 2015-07-12修回）

（本文編輯 陳麗潔）

The impact of isoliquiritigenin on invasive ability of human gastric carcinoma SGC7901 cells

LIU Fangkang，NIU Qiong，WANG Aili，JIA Xingfang，HU Yingbin，LIU Chengxia△
Department of Digestive Medicine，The Affiliated Hospital of Binzhou Medical University，Binzhou 256603，China△

ObjectiveTo investigate the effects of isoliquiritigenin on the invasive ability of human gastric carcinoma SGC7901 cells，and its molecular mechanisms thereof.MethodsThe logarithmic phase human gastric carcinoma SGC7901 cells were divided into control group（normal cell culture fluid）and isoliquiritigenin group（isoliquiritigenin solu?ble in cell culture fluid，the concentrations were 10，25，50 and 100 μmol/L respectively）.Each group had four repeated holes.The proliferation of SGC7901 cells were detected with MTT assay after 24 h，48 h and 72 h of culture.The experimen?tal drug concentration and action time were researched for the subsequent experiments.The in vitro invasion abilities of SGC7901 cells were assessed with Transwell test.The expression levels of MMP9，Akt and P-Akt were detected by Western blot assay.ResultsThe proliferation of SGC7901 cells were inhibited by 10 μmol/L isoliquiritigenin，which can be signifi?cantly inhibited by 25，50 and 100 μmol/L isoliquiritigenin in a concentration-dependent and time-dependent manner.The half inhibitory concentrations（IC50）of 24，48 and 72 h were 52.48，44.49 and 32.50 μmol/L，respectively.Therefore，the 25，50 and 100 μmol/L isoliquiritigenin were selected as the subsequent experimental drug concentration，and 24 h was used as the action time.Compared with the control group（209.75±9.29），the membrane cell number of 25 μmol/L（138.50±10.15），50 μmol/L（89.50±16.56）and 100 μmol/L（45.00±8.08）decreased gradually（F=267.948，P＜0.05）.There was no signifi?cant difference in the expression level of Akt protein between four groups（F=1.492）.The expression levels of P-Akt and MMP9 were gradually decreased with the increase of the isoliquirigenin concentration（F=359.219 and 431.324，P＜0.05）. ConclusionIsoliquiritigenin can obviously inhibit invasion ability of SGC7901 cells，which may be related to the down reg?ulation of the signal transduction pathway protein PI3K/Akt and the down steam protein MMP9.

glycyrrhiza uralensis；stomach neoplasms；matrix metalloproteinase 9；isoliquiritigenin；invasive ability；PI3K/Akt；Akt；P-Akt

R573.9

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.012

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（郵編256603）

劉方康（1988），男，碩士在讀，主要從事消化道腫瘤研究

△通訊作者E-mail:phdlcx@163.com