生長(zhǎng)期膳食缺鋅小鼠腎細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究

田娟，郭芳，李曉明

生長(zhǎng)期膳食缺鋅小鼠腎細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究

田娟，郭芳，李曉明

目的觀察膳食缺鋅條件下生長(zhǎng)期小鼠腎細(xì)胞凋亡情況、氧化應(yīng)激情況及凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax的表達(dá)變化，探討鋅缺乏誘發(fā)腎細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法將剛斷乳雄性小白鼠30只隨機(jī)分為缺鋅組和足鋅組，每組15只。缺鋅組喂飼缺鋅飼料（0.85 mg/kg），足鋅組喂飼足鋅飼料（30 mg/kg）。應(yīng)用TUNEL法觀察小鼠腎細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡指數(shù)；分別應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測(cè)定腎超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量；應(yīng)用蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)腎組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)變化。結(jié)果與足鋅組比較，缺鋅組小鼠腎可見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增多，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加；抗氧化酶SOD活性下降，MDA增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)；凋亡相關(guān)因子Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯下降，Bax蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，Bcl-2/Bax比值下降。結(jié)論生長(zhǎng)期膳食缺鋅導(dǎo)致腎細(xì)胞抗氧化酶活性降低，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)及細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)改變，最終導(dǎo)致腎細(xì)胞發(fā)生凋亡。

鋅；細(xì)胞凋亡；腎；氧化性應(yīng)激；bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)；缺鋅

鋅是機(jī)體內(nèi)重要的微量元素，在體內(nèi)分布廣泛。鋅的功能包括：參與多種酶和激素的合成，維持生物膜的結(jié)構(gòu)、功能和上皮細(xì)胞的正常形態(tài)，調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)和發(fā)育等［1］。細(xì)胞凋亡是基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究表明，缺鋅可導(dǎo)致機(jī)體腦、肝、腎、睪丸以及免疫系統(tǒng)的細(xì)胞發(fā)生凋亡［2-3］。特別是在生長(zhǎng)期，缺鋅可導(dǎo)致大鼠胸腺和睪丸細(xì)胞凋亡，甚至萎縮［4］。前期實(shí)驗(yàn)表明，生長(zhǎng)期膳食缺鋅可導(dǎo)致小鼠腎臟形態(tài)學(xué)改變和腎單位數(shù)目減少。為進(jìn)一步觀察鋅離子對(duì)小鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能的影響，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TUNEL法觀察生長(zhǎng)期缺鋅小鼠腎細(xì)胞凋亡情況，并檢測(cè)腎組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，探討膳食缺鋅引起腎細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇剛斷乳雄性清潔級(jí)小白鼠30只，體質(zhì)量13～16 g，平均（14.27±0.85）g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［醫(yī)動(dòng)字第SCXY（遼）2003-2007號(hào)］。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為缺鋅組和足鋅組，每組15只。其中缺鋅組喂飼缺鋅飼料（0.85 mg/kg），足鋅組喂飼足鋅飼料（30 mg/kg）［5］。動(dòng)物單籠喂養(yǎng)8周，自由飲用去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑兔抗小鼠B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）克隆抗體和兔抗小鼠Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）多克隆抗體購(gòu)自Santa cruz公司，原位缺口末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司，超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，細(xì)胞骨架蛋白（β-actin）鼠單克隆抗體購(gòu)自上海康成生物工程有限公司，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、蛋白標(biāo)志物購(gòu)自美國(guó)NEB公司，底物化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.3 標(biāo)本制備將小鼠用水合氯醛麻醉，剖腹取出腎臟。左腎經(jīng)橫向排刀法切開(kāi)后入4%多聚甲醛固定，乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟定向包埋，對(duì)各組織塊做5.0 μm厚度的切片，用于TUNEL染色。取部分右腎組織0.4 g，用冷生理鹽水制成10%組織勻漿，用于檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)；其余右腎組織置于-80℃冰箱用于蛋白印跡檢測(cè)。

1.4 TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫（H2O2）室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，各5 min，加蛋白酶K工作液37℃消化20 min，PBS漂洗3次，各5 min，加TUNEL反應(yīng)液37℃孵育1 h，PBS漂洗3次，含辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的抗熒光素抗體37℃避光孵育30 min，PBS漂洗3次，各5 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染后脫水，透明，封片。陰性對(duì)照TUNEL反應(yīng)液中不加末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）。

1.5 凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）的計(jì)算細(xì)胞核呈棕黃色的細(xì)胞為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞。每組隨機(jī)取5張TUNEL陽(yáng)性切片，每張切片分別隨機(jī)取3個(gè)非重疊高倍視野，在CIAS-1000細(xì)胞圖像分析儀上記數(shù)總細(xì)胞數(shù)和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，即AI=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA的檢測(cè)分別采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量。按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各管吸光度（A）值，并計(jì)算SOD、MDA含量。

1.7 蛋白印跡法檢測(cè)Bcl-2、Bax的表達(dá)情況取冷凍待用的右腎組織，用小剪刀將組織塊盡量剪碎（冰上操作），加入4倍體積的蛋白裂解液，超聲粉碎，4℃過(guò)夜，冷凍離心機(jī)（12 000 r/min）4℃離心30 min，去除細(xì)胞碎片。取上清液，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。樣品取50 μg與6×十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液混合，100℃煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（1∶500）4℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，HRP-ECL蛋白檢測(cè)發(fā)光鑒定，凝膠電泳圖像分析儀進(jìn)行采圖［6］。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL染色結(jié)果與足鋅組相比，缺鋅組小鼠腎小體體積明顯減小，凋亡細(xì)胞明顯增加；腎小管包括近端小管、遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，見(jiàn)圖1。

Fig.1The TUNEL-positive renal cells for two groups of mice（TUNEL staining，×400）圖1 2組小鼠腎臟TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)（TUNEL染色，×400）

2.2 AI比較足鋅組、缺鋅組小鼠腎臟細(xì)胞AI分別為（1.41±0.21）%、（9.52±0.13）%，缺鋅組明顯高于足鋅組（t=127.02，P＜0.01）。

2.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)比較與足鋅組相比，缺鋅組小鼠腎細(xì)胞SOD活性下降，MDA含量增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1Comparison of the index of oxidative stress in kidney between two groups of mice表1 2組小鼠腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（n=15，）

Tab.1Comparison of the index of oxidative stress in kidney between two groups of mice表1 2組小鼠腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（n=15，）

*P＜0.05

M D A（μ m o l / g蛋白）0 . 4 1 ± 0 . 3 4 0 . 5 3 ± 0 . 1 5 2 . 1 9 *組別足鋅組缺鋅組t S O D（U / m g蛋白）6 6 . 3 7 ± 1 8 . 1 2 5 0 . 4 2 ± 1 1 . 2 4 2 . 8 4 *

2.4 蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果與足鋅組比較，缺鋅組小鼠腎臟Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)（t=2.41，P＜

0.05），Bax蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)（t=2.52，P＜0.01），Bcl-2/Bax比值下降，見(jiàn)圖2。

Fig.2The expression changes of Bcl-2 and Bax in kidney in two groups of mice圖2 2組小鼠腎臟Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)變化

3 討論

鋅對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程有重要的生物學(xué)影響。通常情況下，鋅以鋅離子、鋅依賴酶或其他鋅蛋白形式參與并調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程。生理濃度的鋅可抑制細(xì)胞凋亡，而缺鋅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Nodera等［2］研究發(fā)現(xiàn)缺鋅導(dǎo)致大鼠胸腺、睪丸、皮膚、食管、肝和腎等器官中的細(xì)胞發(fā)生凋亡。Tomat等［7-8］研究證實(shí)缺鋅會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)期大鼠腎臟腎小球?yàn)V過(guò)率下降，腎單位數(shù)目減少，腎臟凋亡細(xì)胞數(shù)目增加等。體外實(shí)驗(yàn)顯示缺鋅培養(yǎng)基或鋅螯合劑可誘導(dǎo)多種細(xì)胞的凋亡［9］。本實(shí)驗(yàn)觀察到膳食鋅缺乏會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)期小鼠腎細(xì)胞發(fā)生凋亡，與以往研究結(jié)果相同，但其具體機(jī)制尚不清楚。

鋅具有抗氧化作用，缺鋅會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。生理?xiàng)l件下，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，SOD是機(jī)體主要的自由基清除酶之一。鋅對(duì)于穩(wěn)定SOD的立體結(jié)構(gòu)咪唑橋的活性中心起著重要的作用，鋅含量下降可能導(dǎo)致SOD酶蛋白的立體結(jié)構(gòu)被破壞，使SOD失去酶促催化循環(huán)功能，表現(xiàn)為SOD活性降低，自由基清除不足，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物催化裂解產(chǎn)生MDA，MDA對(duì)細(xì)胞有毒性作用，可與蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡［10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺鋅小鼠腎組織中SOD活性降低，MDA含量增高，提示鋅離子缺乏導(dǎo)致腎組織內(nèi)抗氧化系統(tǒng)被破壞，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。

另外，在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，凋亡相關(guān)因子表達(dá)及活性會(huì)發(fā)生改變。研究表明，Bcl-2家族的表達(dá)和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡蛋白，并且Bax是Bcl-2活性的主要調(diào)控因子，Bcl-2與Bax蛋白的比值決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，膳食缺鋅可導(dǎo)致發(fā)育期小鼠腎臟中抑制凋亡因子Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，而促進(jìn)凋亡因子Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax比值下降，由此推測(cè)其可能是腎細(xì)胞凋亡增加的原因之一。

綜上所述，膳食缺鋅可導(dǎo)致生長(zhǎng)期小鼠腎細(xì)胞抗氧化酶活性降低，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)及細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)改變，最終導(dǎo)致腎細(xì)胞發(fā)生凋亡。這一改變是否會(huì)影響腎臟功能及誘發(fā)相應(yīng)的腎臟疾病，仍有待于下一步的研究證實(shí)。

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（2015-04-29收稿 2015-05-26修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Study on the mechanism of apoptosis of mouse kidney cells in dietary zinc deficiency during the growth period

TIAN Juan，GUO Fang，LI Xiaoming
Department of Histology and Embryology，Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China

ObjectiveTo observe the cell apoptosis，oxidative stress reaction and expressions of Bcl-2 and Bax in kid?ney of dietary zinc deficiency mice during growth period，and discuss the mechanism of renal cell apoptosis induced by zinc deficiency.MethodsThirty weaning male mice were randomly divided into zinc-deficient group and zinc-adequate group，and 15 mice for each group.Zinc-deficient group was fed with zinc deficiency diet（0.85 mg/kg），while zinc-adequate group was fed with enough zinc diet（30 mg/kg）.The TUNEL method was applied to observe the cell apoptosis，and the apoptotic in?dex was measured.The content of SOD and MDA were detected to observe the oxidative stress reaction in kidney.The ex?pression levels of Bcl-2 and Bax protein were detected by Western blot assay.ResultsCompared with zinc-adequate group，the cell apoptosis and oxidative stress reaction were increased in zinc-deficient group.The expression of Bcl-2 de?creased，and the expression of Bax increased.The ratio of Bcl-2 and Bax declined in kidney of zinc deficiency mice.Conclu?sionDiet zinc deficiency in growth period may result in the decreased antioxidase，the increased oxidative stress reaction，and the changed Bcl-2 and Bax expression，which promote the occurrence of cell apoptosis in kidney.

zinc；apoptosis；kidney；oxidative stress；bcl-2-associated X protein；zinc deficiency

R737.1

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.016

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（2013022067）；遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（L2012307）；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410160037）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410160037）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才項(xiàng)目（LJQ2013092）

遼寧醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室（郵編121001）

田娟（1976），女，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事腎臟發(fā)育生物學(xué)研究