利用四唑鹽染料WST反映巨噬細胞受脂多糖刺激活化后的氧化應激和代謝變化

鞠瑞，陳瑋，陳晨，郭磊，李娟，葉菜英，張德昌

利用四唑鹽染料WST反映巨噬細胞受脂多糖刺激活化后的氧化應激和代謝變化

鞠瑞，陳瑋，陳晨，郭磊，李娟，葉菜英，張德昌

目的 通過四唑鹽染料顯色方法分析巨噬細胞受脂多糖刺激后的氧化應激和代謝變化，分析這種方法在炎癥研究中的應用價值。

方法 通過活細胞計數方法和 CCK-8 檢測試劑分別檢測RAW264.7 巨噬細胞的活力；用 CCK-8 和 WST-1 顯色方法研究超氧陰離子的釋放；用 DCFH-DA 熒光染色和流式細胞術檢測細胞內活性氧的生成；用乳酸檢測試劑盒和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 NAD+（H） 檢測試劑盒分別檢測上清中乳酸和細胞內 NADH 的含量。

結果 經脂多糖刺激的 RAW264.7 細胞的活細胞計數結果和 CCK-8 顯色結果存在反差；相同數目的正常培養細胞和脂多糖刺激細胞的 CCK-8 顯色比較，后者讀數顯著升高，超氧化物歧化酶能夠下調 CCK-8 顯色讀數，WST-1 顯色結果與 CCK-8 一致，脂多糖刺激細胞中的活性氧含量顯著增加；脂多糖導致 RAW264.7 細胞上清中的乳酸含量和細胞內的 NADH 含量顯著增加。

結論 應用 WST 染料測定經脂多糖刺激的 RAW264.7細胞活力時，測定結果會受到細胞中還原性物質——超氧陰離子和 NADH含量變化的干擾。通過 WST-1 或 WST-8顯色實驗，可驗證脂多糖能夠刺激 RAW264.7 巨噬細胞發生氧化應激和能量代謝變化。這一顯色實驗在炎癥研究和藥物篩選中可能有重要應用價值。

脂多糖類； 氧化性應激； 能量代謝； 四唑鹽染料

四唑鹽是一種被廣泛用于細胞活性、細胞代謝和超氧化物檢測的重要試劑。噻唑藍（MTT）是檢測細胞活性的常規試劑之一，其檢測原理是大部分MTT 可被細胞內還原型的吡啶核苷酸——輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）還原，從而間接反映細胞活力。近年來，第二代四唑鹽——水溶性四唑鹽（WST）得到廣泛應用。與 MTT 相比，WST （WST-1 或 WST-8）主要有兩個特點，一是不可通過細胞膜，二是被還原生成的甲瓚為水溶性物質。其中 WST-1 是 WST 系列的第一個四唑鹽試劑，WST-8 相比 WST-1 更加穩定，靈敏度更高，溶解性更強。由于 WST 不可通過細胞膜，如果在沒有中間電子載體 1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯鹽（1-mPMS）的情況下顯色，則是因為被釋放至細胞外的超氧陰離子還原，可反映細胞超氧陰離子的釋放和呼吸爆發情況；如果在 1-mPMS 存在的情況下顯色，不僅反映超氧陰離子的生成，還可能是通過 1-mPMS 接受了細胞膜上的跨膜電子，可以反映細胞內 NADH 生成的情況［1-2］。NADH 的含量變化以及 NAD+/NADH 比值的變化是細胞代謝變化的重要指標，可反映線粒體三羧酸循環和電子傳遞鏈活性的改變［3］。

脂多糖（LPS）可以刺激巨噬細胞的經典活化，引發強烈的炎癥反應，釋放大量的炎癥細胞因子。Check 等［4］采用高鐵細胞色素 c 還原的方法進行檢測表明，RAW264.7 巨噬細胞經 LPS 刺激后，細胞膜上的 NADPH 氧化酶活性顯著升高，釋放的超氧陰離子增多。

在 LPS 刺激巨噬細胞炎癥反應的過程中，細胞能量代謝的變化參與其中，并發揮重要作用。LPS會促進巨噬細胞利用糖酵解進行能量代謝，其原因之一是 LPS 引起巨噬細胞線粒體功能損傷，這一代謝變化伴隨著 NADH 的聚積和 NADH/NAD+的比值升高。糖酵解抑制劑 2-脫氧葡萄糖（2-DG）能夠抑制 LPS 引起的 IL-1β 和 TNF-α 的生成，顯示了糖酵解代謝在炎癥反應中的重要作用［5］。

我們在檢測 LPS 刺激 RAW264.7 細胞后的細胞活力時發現，以 WST-8 為主要成分的 CCK-8細胞計數試劑盒的檢測結果和活細胞鏡下計數結果存在差異。我們對經 LPS 刺激后 RAW264.7 細胞超氧陰離子產生及 NADH 含量進行檢測。結果顯示，WST 在這一實驗體系中的還原可能是 LPS促進巨噬細胞氧化應激和代謝改變（NADH 增加）導致的。由于氧化應激和糖酵解增加是炎癥反應的重要環節，因此我們認為，WST 與其中間電子載體 1-mPMS 可能會在抗炎藥物篩選方面有重要應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 RAW264.7 巨噬細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心，用DMEM 高糖培養基（加入 10% 胎牛血清、1% 谷氨酰胺、50 mg/ml 青霉素和 100 mg/ml 鏈霉素）在 37 ℃、5% CO2環境中培養。

1.1.2 試劑 LPS、臺盼藍購自美國 Sigma 公司；L-乳酸檢測試劑盒購自德國 R-Biopharm 公司；WST-1、WST-8 試劑（CCK-8）購自同仁化學公司；活性氧檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司；NAD+（H） 濃度測定試劑盒購自美國 Bioassay Systems 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞臺盼藍染色計數 收集處于對數生長期的 RAW264.7 細胞接種于 24 孔板中，2 × 105個/孔。將細胞分兩組處理：一組為對照組，以正常培養基培養；另一組為 LPS 組，以含 100 ng/ml LPS 的培養基培養。每組 3 復孔。培養 4、12、24 h后消化收集各孔細胞。將細胞懸液以 1000 r/min 離心 5 min 后，以 1 ml PBS 重懸細胞。將 90 μl 細胞懸液與 10 μl 0.5% 臺盼藍染液混勻。在光學顯微鏡下進行活細胞計數。

1.2.2 CCK-8檢測 收集處于對數生長期的RAW264.7 細胞接種于 24 孔板中，2 × 105個/孔。將細胞分兩組處理：一組為對照組，以正常培養基培養；另一組為 LPS 組，以含 100 ng/ml LPS 的培養基培養。每組 3 復孔。培養 4、12、24 h 后，吸棄各孔上清，每孔加入 500 μl PBS 及 50 μl WST-8 試劑，混勻。設置空白孔，為不含細胞的500 μl PBS及 50 μl WST-8 試劑。放置在培養箱中培養 2 h，每孔上清搖勻，將每孔 200 μl 上清加入至 96 孔板中，每組 4 復孔。測定 450 nm 處吸光度。

1.2.3 WST-1檢測 收集處于對數生長期的RAW264.7 細胞接種于中皿中，1 × 106個/皿。將細胞分兩組處理：一組為對照組，以正常培養基培養；另一組為 LPS 組，以含 100 ng/ml LPS 的培養基培養。培養 24 h 后，將兩組細胞分別消化，用HBSS 重懸調整成為 1 × 106個/ml。然后將細胞懸液加入至 96 孔板中，160 μl/孔。再向每孔中加入20 μl HBSS 及 20 μl WST-1（5 mmol/L，10 ×）溶液或 CCK-8 試劑?；靹蚝蠓胖?37 ℃ 孵育 30 min后測定 450 nm 吸光度。

1.2.4 細胞內 ROS 檢測 收集處于對數生長期的 RAW264.7 細胞接種于中皿中，1 × 106個/皿。將細胞分兩組處理：一組為對照組，以正常培養基培養；另一組為 LPS 組，以含 100 ng/ml LPS 的培養基培養。培養 24 h 后，將兩組細胞分別消化，重懸于稀釋好的 DCFH-DA（10 μmol/L），調細胞懸液密度為 1 × 106個/ml?；靹蚝蠓胖?37 ℃ 孵育 30 min，然后用無血清培養基洗滌細胞 3 次，進行流式細胞術檢測。

1.2.5 細胞上清中乳酸含量檢測 收集處于對數生長期的 RAW264.7 細胞接種于 24 孔板中，2 × 105個/孔。將細胞分兩組處理：一組為對照組，以正常培養基培養；另一組為 LPS 組，以含 100 ng/ml LPS 的培養基培養。每組 3 復孔。培養 24 h 后，收集各孔細胞的培養上清，按照 L-乳酸檢測試劑盒的說明步驟對乳酸含量進行測定。

1.2.6 細胞內 NADH 含量檢測 收集處于對數生長期的 RAW264.7 細胞接種于大皿中，1 × 107個/皿。將細胞分兩組處理：一組為對照組，以正常培養基培養；另一組為 LPS 組，以含 100 ng/ml LPS 的培養基培養。培養 24 h 后，消化收集細胞，按照 NADH 濃度測定試劑盒的說明步驟對NADH 濃度進行測定。

1.3 統計學處理

應用 SPSS 13.0 軟件進行數據處理，對照組與誘導組檢測結果比較采用 Student's t 檢驗，以 P ＜0.05 為有統計學意義的差異。

2 結果

2.1 CCK-8 檢測經 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞活力受到其他因素干擾

通過顯微鏡觀察發現，經 LPS 刺激的RAW264.7 細胞相比對照組體積變大，數目減少。用臺盼藍染色的方法對活細胞進行計數，發現 LPS處理 24 h 后細胞數目顯著減少（圖 1A），與鏡下觀察一致。用 CCK-8 試劑對細胞活力進行檢測，LPS 組的 OD450自誘導 4 h 開始便顯著高于對照組（圖 1B）。因此在這一實驗條件下，CCK-8 的顯色結果與細胞活力變化不一致。

圖1 正常培養和 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞 24 h 內活細胞計數（A）和 CCK-8 檢測結果（B）（**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001）Figure 1 Live cell counts （A） and CCK-8 absorbance at 450 nm （B） of RAW264.7 macrophages in control and LPS groups during 24 h （**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001）

圖2 LPS 刺激引起 RAW264.7 細胞的氧化應激（A、B：正常培養和 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞調整為相同數目后的CCK-8 和 WST-1 顯色差異；C：RAW264.7 細胞中活性氧含量改變；*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001）Figure 2 Oxidative stress elicited in RAW264.7 macrophages by LPS （A and B： CCK-8 and WST-1 tests of same amounts of RAW264.7 macrophages in control and LPS groups； C： Reactive oxygen species in RAW264.7 macrophages in control and LPS groups；*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001）

將正常培養和經過 LPS 刺激 24 h 的RAW264.7 細胞調成相同的密度，然后加入至96 孔板中。向各孔細胞中加入 CCK-8 或 WST-1試劑。30 min 后 OD450檢測結果顯示，LPS 組細胞的 CCK-8 讀數相比正常對照組顯著升高，而在LPS 組細胞中加入超氧化物歧化酶（SOD）后，OD450讀數顯著降低（圖 2A）。LPS 組細胞的WST-1 讀數相比正常對照組也顯著升高（圖 2B）。WST-1 反應體系與 CCK-8 反應體系相比，不含有中間電子載體 1-mPMS，因此 WST-1 無法被跨膜電子還原，其讀數升高反映的是被釋放至胞外的超氧陰離子增加。為驗證 CCK-8 或 WST-1 檢測的氧化應激結果，我們用 DCFH-DA 對胞內活性氧進行檢測，發現 LPS 可顯著增加 RAW264.7 細胞中活性氧的含量（圖 2C）。因此，經 LPS 刺激的RAW264.7 細胞 CCK-8 讀數升高部分歸因于細胞超氧陰離子的生成增加。

2.3 LPS 顯著增加 RAW264.7 細胞乳酸生成和NADH 含量

CCK-8 試劑中的 WST-8 通過中間電子載體1-mPMS 接受來自細胞膜上的電子，這些電子主要來自細胞內的 NADH。胞內 NADH 可通過細胞膜上的 NADH 氧化酶將電子傳遞給氧氣，生成超氧陰離子，進而還原 WST-8，也可以通過細胞膜上的泛醌循環將電子傳遞給 1-mPMS，進而還原WST-8。因此，在 1-mPMS 存在的情況下，CCK-8讀數的升高不僅可反映 NADH 氧化酶活性升高和氧化應激，還可能反映細胞內 NADH 含量升高。

以 LPS 刺激 RAW264.7 細胞 24 h，培養上清中的酚紅指示上清明顯酸化。經過測定，發現 LPS處理組的乳酸含量相比對照組顯著升高（圖 3A），顯示 LPS 促進 RAW264.7 巨噬細胞通過糖酵解途徑進行代謝。這一結果提示 LPS 對線粒體能量代謝有干擾并可能促進線粒體內 NADH 蓄積。對RAW264.7 細胞內的 NADH 含量進行測定，結果顯示 LPS 顯著增加 RAW264.7 細胞內 NADH的含量（圖 3B）。因此，經 LPS 刺激的 RAW264.7細胞 CCK-8 讀數升高的另一部分原因可能是細胞內 NADH 含量的增加，可能反映了細胞能量代謝的變化。

3 討論

四唑鹽顯色方法是檢測細胞增殖和活力的常用方法，其染料吸光度與活細胞數目有著很好的相關性。但是在某些實驗體系中，如用于 LPS 刺激的巨噬細胞檢測時，其檢測結果會受到明顯的干擾。根據第二代四唑鹽——不可通過細胞膜的WST 染料的檢測原理，其檢測結果反映的是細胞超氧陰離子產生和代謝方面的變化［1-2， 6-9］。

具體說來，在沒有其中間電子載體 1-mPMS存在時，WST-1 可直接用于胞外超氧陰離子的檢測，其檢測性能優于高鐵細胞色素 c［8］；在電子載體 1-mPMS 存在的情況下，WST-1 還可能反映細胞內 NADH 的含量。對細胞代謝有顯著影響的藥物，如減少 NADH 消耗的 rotenone、azide 等藥物能夠促進 WST-1 的還原；而能夠減少糖酵解NADH 生成的 2-脫氧葡萄糖，則顯著抑制 WST-1的還原［9］。在巨噬細胞炎癥活化過程中，氧化應激是比較明確的現象，而能量代謝在其中的作用也被日益重視。因此，當細胞數沒有顯著變化，或者CCK-8 檢測與細胞計數結果存在差異時，鑒于氧化應激和代謝變化在炎癥活化中的重要作用，可以通過測定 WST 染料的還原來判斷炎癥的激活。

圖3 LPS 刺激增加 RAW264.7 細胞培養上清中乳酸含量（A）和細胞內NADH含量（B）（*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01）Figure 3 Lactic acid in RAW264.7 culture medium （A） and intracellular NADH （B） were increased by LPS （*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01）

LPS 是刺激巨噬細胞經典活化的典型物質，能夠導致線粒體功能損傷，并且顯著增加糖酵解代謝。有報道指出小膠質細胞 BV-2 被 LPS 激活的炎癥反應伴隨著糖酵解代謝的增強［10］。糖酵解抑制劑 2-脫氧葡萄糖能夠抑制 LPS 引起的巨噬細胞內 IL-1β 和 TNF-α 的生成，顯示了糖酵解在 LPS刺激炎癥活化過程中的重要參與［5］。

我們利用 CCK-8 的直接檢測原理對 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞進行檢測，檢測讀數顯著升高，與真實細胞活力不符。這一結果實際反映了LPS 引起的氧化應激，還可能會反映代謝變化。CCK-8 檢測結果被 WST-1 顯色、胞內活性氧檢測及胞內 NADH 含量檢測的結果證實。因此，WST染料在炎癥活化的檢測和抗炎藥物的篩選方面可能會有重要應用價值。

［1］Berridge MV， Herst PM， Tan AS. Tetrazolium dyes as tools in cell biology： new insights into their cellular reduction. Biotechnol Annu Rev， 2005， 11：127-152.

［2］Kimura Y， Niki K. Electrochemical oxidation of nicotineamide-adenine dinucleotide （NADH） by modified pyrolytic graphite electrode. Anal Sci， 1985， 1（3）：271-274.

［3］Fendt SM， Bell EL， Keibler MA， et al. Reductive glutamine metabolism is a function of the α-ketoglutarate to citrate ratio in cells. Nat Commun， 2013， 4：2236.

［4］Check J， Byrd CL， Menio J， et al. Src kinase participates in LPS-induced activation of NADPH oxidase. Mol Immunol， 2010，47（4）：756-762.

［5］Tannahill GM， Curtis AM， Adamik J， et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL-1β through HIF-1α. Nature， 2013，496（7444）：238-242.

［6］Ukeda H， Shimamura T， Tsubouchi M， et al. Spectrophotometric assay of superoxide anion formed in maillard reaction based on highly water-soluble tetrazolium salt. Anal Sci， 2002， 18（10）：1151-1154.

［7］Xu C， Liu S， Liu Z， et al. Superoxide generated by pyrogallol reduces highly water-soluble tetrazolium salt to produce a soluble formazan： a simple assay for measuring superoxide anion radical scavenging activities of biological and abiological samples. Anal Chim Acta， 2013，793：53-60.

［8］Berridge MV， Tan AS. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt， WST-1 to produce a soluble formazan： a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammation agents. J Immunol Methods， 2000， 238（1-2）：59-68.

［9］Tan AS， Berridge MV. Trans-plasma membrane electron transport： a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular，superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma， 1998， 205（1-4）：74-82.

［10］Voloboueva LA， Emery JF， Sun X， et al. Inflammatory response of microglial BV-2 cells includes a glycolytic shift and is modulated by mitochondrial glucose-regulated protein 75/mortalin. FEBS lett， 2013，587（6）：756-762.

Methods Viability of RAW264.7 macrophages were determined by trypan blue excluding test and CCK-8 test， respectively. Superoxide production was measured by CCK-8 or WST-1. Reactive oxygen species were measured by flow-cytometry with DCFH-DA. Lactic acid production and reduced form of nicotineamide adenine dinucleotide （NADH） concentration were also determined.

Results Inconsistent results of the LPS-stimulated RAW264.7 macrophages viability were obtained with trypan blue excluding test and CCK-8 assay. CCK-8 absorbance was significantly elevated in LPS-stimulated macrophages as compared to the same amount of macrophages cultured normally， which could be inhibited by superoxide dismutase （SOD）. The result of WST-1 reduction was similar with CCK-8. Lactic acid in the culture medium， intracellular reactive oxygen species and NADH were all significantly increased by LPS.

Conclusion When being used to test the LPS-stimulated macrophages， WST tetrazolium salt reduction reflecting cell viability was significantly disturbed by the content of reduced substances including the superoxide and NADH. WST tetrazolium salt reduction test might be a useful tool in the inflammation research and the anti-inflammation drug screening.

Oxidative stress and metabolic changes in LPS-stimulated macrophages tested by WST tetrazolium salts

JU Rui， CHEN Wei， CHEN Chen， GUO Lei， LI Juan， YE Cai-ying， ZHANG De-chang

Objective To investigate the oxidative stress and metabolic changes in LPS-stimulated macrophages via the spectrophotometric assay based on WST tetrazolium salts， and analyze the application value of WST in inflammatory research.

Lipopolysaccharides； Oxidative stress； Energy metabolism； Tetrazolium salts

s： ZHANG De-chang， Email： zhangdechang45@vip.sina.com； YE Cai-ying， Email： caiyingye@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.009

“十二五”國家科技重大專項（2014ZX09507003-003）；國家自然科學基金（81201728）；高等學校博士學科點專項科研基金新教師類（20121106120019）

100005 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院基礎醫學研究所藥理學系

張德昌，Email：zhangdechang45@vip.sina.com；葉菜英，Email：caiyingye@126.com

2015-01-08

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術， 2015， 10（3）：242-247

Author Affiliation： Department of Pharmacology， Institute of Basic Medical Sciences， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100005， China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol， 2015， 10（3）：242-247