甘草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)蘆薈大黃素的選擇性糖基化

張德武，陶小宇，余利巖，戴均貴

甘草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)蘆薈大黃素的選擇性糖基化

張德武，陶小宇，余利巖，戴均貴

目的 研究甘草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)蘆薈大黃素的生物轉(zhuǎn)化。

方法 將蘆薈大黃素與甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)細(xì)胞共孵育 7 d后，培養(yǎng)液經(jīng)由大孔吸附樹脂處理，細(xì)胞用甲醇提取，合并兩部分浸膏后依次采用 Sephadex LH-20 凝膠柱色譜、正相硅膠柱色譜、反相半制備 HPLC 等技術(shù)進(jìn)行分離純化，利用質(zhì)譜和核磁共振波譜技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

結(jié)果 分離得到了一個(gè)蘆薈大黃素的選擇性糖基化產(chǎn)物——蘆薈大黃素-（3-羥甲基）-O-β-D-葡萄糖苷。

結(jié)論 甘草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)蘆薈大黃素具有位置選擇性糖基化能力。

蘆薈大黃素； 甘草； 糖基化； 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

蘆薈大黃素（aloe-emodin）是蓼科植物掌葉大黃的根和塊莖中的一種活性成分，屬于蒽醌類化合物。作為來源于傳統(tǒng)中藥的一種重要的活性成分，該化合物具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、清除自由基等多種藥理活性，但水溶性不足使其應(yīng)用受限［1-7］。通過生物轉(zhuǎn)化往往能獲得化學(xué)合成難以得到的新穎結(jié)構(gòu)，并且在位置選擇方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，此技術(shù)在天然產(chǎn)物及化學(xué)合成藥物的結(jié)構(gòu)改造方面的研究越來越受到藥物學(xué)家的重視［8-10］。植物生物轉(zhuǎn)化是利用植物細(xì)胞中的酶體系使底物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的過程。研究表明，離體植物細(xì)胞培養(yǎng)體系具有糖基化、去糖基化、酯化、氧化、甲基化、水解、異戊烯基化等多種生物轉(zhuǎn)化能力［11-14］。目前，尚無利用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系對(duì)蘆薈大黃素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化方面的研究報(bào)道。本文首次采用甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系對(duì)蘆薈大黃素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物細(xì)胞 甘草種子采自寧夏，由中央民族大學(xué)楊林副教授鑒定為烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）。種子細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)，繼代培養(yǎng)，并保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 儀器 AutoSpec Ultima-TOF 質(zhì)譜儀為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品；MP-400 及 ARX-500型核磁共振波譜儀為美國布魯克公司產(chǎn)品；島津LC-6AD 型半制備型高效液相色譜儀為日本島津公司產(chǎn)品；Adsorbosphere XL C18（250 mm × 10 mm，5 μm）反相半制備色譜柱為美國 WR Grace 公司產(chǎn)品。

1.1.3 試劑 分析純的乙醇、甲醇、氯仿、丙酮、石油醚為北京化工廠生產(chǎn)；色譜級(jí)甲醇和乙腈為美國 Burdick & Jackson 公司生產(chǎn)；柱色譜用硅膠和GF254硅膠板為煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所生產(chǎn)；Sephadex LH-20 由美國 GE 公司生產(chǎn)。

1.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)基 MS 培養(yǎng)基：NH3NO31.65 g/L、KNO31.90 g/L、KH2PO40.17 g/L、MgSO4·7H2O 0.37 g/L、CaCl2·H2O 0.44 g/L、KI 0.83 mg/L、H3BO36.20 mg/L、CoCl2·6H2O 0.025 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L、MnSO4·4H2O 22.30 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.60 mg/L、FeSO4·7H2O 27.80 mg/L、EDTA-Na237.30 mg/L、肌醇 100 mg/L、VB60.50 mg/L、VB10.10 mg/L、甘氨酸 2 mg/L、煙酸 0.50 mg/L、蔗糖 40 g/L、萘乙酸 0.2 mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸 0.5 mg/L、6-芐氨基腺嘌呤0.5 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將甘草種子浸泡在盛滿清水的培養(yǎng)皿中，置于 4 ℃ 冰箱里 1 ～ 2 d，挑選飽滿、顏色偏綠、較為鮮亮的種子，用 70% 的乙醇表面滅菌 30 s 后，用 0.1% 氯化汞溶液表面滅菌10 min，然后用 5 倍量的蒸餾水漂洗 3 次，用無菌濾紙將水吸干。將滅菌后的種子接種在 MS 固體培養(yǎng)基上，在光照條件下培養(yǎng)。待無菌苗長高至約 5 cm 后，于超凈臺(tái)上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，并進(jìn)行甘草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立，具體方法參照文獻(xiàn)［12］。

1.2.2 生物轉(zhuǎn)化 將生長在 500 ml 三角瓶中、狀態(tài)良好的甘草細(xì)胞轉(zhuǎn)接至 1000 ml 三角瓶中，接種量 2 g/瓶（細(xì)胞干重），于（25 ± 1）℃，120 r/min條件下培養(yǎng) 10 d，投入底物 100 μl/瓶（300.0 mg 蘆薈大黃素溶于 1200 μl 二甲基甲酰胺中）。之后將細(xì)胞繼續(xù)于（25 ± 1）℃ 黑暗條件下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速 120 r/min，7 d 后收獲。

1.2.3 提取分離 將細(xì)胞和培養(yǎng)液抽濾分離，通過 HPLC 分析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物大部分存在于細(xì)胞中，少量出現(xiàn)在培養(yǎng)液部分。將培養(yǎng)液部分過大孔吸附樹脂柱吸附 2 次，分別用 50%、75% 和 100% 乙醇洗脫，洗脫液減壓回收后合并得浸膏 1.0 g。甘草細(xì)胞置于 56 ℃ 烘箱中烘干，而后用 400 ml 甲醇超聲提取 3 次，每次 50 min，將甲醇部分減壓蒸干得到 5.8 g 浸膏。將兩部分浸膏合并后經(jīng)過Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離得到 13 個(gè)流分（Fr.1 ～ Fr.13），TLC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物存在于 Fr.3 ～Fr.8 中，合并后共 3.7 g。進(jìn)一步通過硅膠柱色譜（200 ～ 300 目）梯度洗脫，得9個(gè)流分（Fr.3-1 ～Fr.3-9），經(jīng)過 TLC檢測(cè)合并含有目的化合物的流分，減壓蒸餾后的浸膏通過反相半制備 HPLC（甲醇：水 = 53：47，v/v，2 ml/min）分離得到粗產(chǎn)物 4.5 mg，進(jìn)一步通過反相半制備 HPLC（乙腈：水 = 18：82，v/v，4 ml/min）得到目的化合物。

2 結(jié)果

2.1 生物轉(zhuǎn)化結(jié)果

300.0 mg 蘆薈大黃素在 4.0 L 甘草懸浮細(xì)胞體系中經(jīng)過 7 d 的轉(zhuǎn)化，通過 TLC 和 HPLC-UV檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（圖 1），運(yùn)用多種色譜技術(shù)分離得到一個(gè)糖基化產(chǎn)物（圖 2）。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

目的化合物為黃色粉末，其 ESI-MS 顯示 m/z：433.3 ［M+H］+，表明其分子量為 432，比蘆薈大黃素的分子量增加了 162，推測(cè)該化合物可能是蘆薈大黃素的糖基化產(chǎn)物。在13C-NMR 譜中多了一組明顯的葡萄糖信號(hào)（δC102.5， 77.2， 76.7， 73.6， 70.1，61.2），以及1H-NMR 譜中的端基氫質(zhì)子信號(hào)，δH4.29（1H， d， J = 7.6 Hz， H-1'），確定該糖為葡萄糖。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］報(bào)道的蘆薈大黃素-3-（羥甲基）-O-β-D-葡萄糖苷的數(shù)據(jù)一致。故鑒定該化合物為蘆薈大黃素-3-（羥甲基）-O-β-D-葡萄糖苷。

圖2 甘草懸浮細(xì)胞系對(duì)蘆薈大黃素的轉(zhuǎn)化反應(yīng)Figure 2 The biotranformation of aloe-emodin by G. uralensis cell suspension cultures

3 討論

本研究首次利用甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系對(duì)蘆薈大黃素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化研究，并獲得了一個(gè)具有位置選擇性的糖基化產(chǎn)物——蘆薈大黃素-3-（羥甲基）-O-β-D-葡萄糖苷，表明甘草細(xì)胞中含有能對(duì)蘆薈大黃素的 3 位羥甲基進(jìn)行位置選擇性糖基化的生物酶。本研究為蒽醌和其他酚類化合物的定向結(jié)構(gòu)改造提供了新思路，同時(shí)，該研究中位置選擇性糖基化反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)為從甘草培養(yǎng)細(xì)胞中獲得糖基轉(zhuǎn)移酶提供了信息。

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Methods Aloe-emodin was added into cell suspension cultures of Glycyrrhiza uralensis and incubated for another 7 d. To obtain residues， the culture medium was processed by a macroporous adsorbent resin column or the cells was extracted with MeOH， and then these two residues was separated and purified by Sephadex LH-20 column chromatography， silica gel column chromatographyand reversed-phase semi-preparative HPLC， successively. Through the processes， a metabolite was achieved. The structure of the metabolite was elucidated on the basis of spectroscopic analyses.

Results A regio-selectively glycosylated product， aloe-emodin-3-（hydroxymethyl）-O-β-D-glucoside， was isolated from the biotransformation of aloe-emodin by G. uralensis cell suspension cultures.

Conclusion The result indicates that the G. uralensis cell suspension cultures possess the regio-selective glycosylated capacity for aloe-emodin.

Regio-selective glycosylation of aloe-emodin by cell suspension cultures of Glycyrrhiza uralensis

ZHANG De-wu， TAO Xiao-yu， YU Li-yan， DAI Jun-gui

Objective To investigate the biotransformation of aloe-emodin by cell suspension cultures of Glycyrrhiza uralensis.

ALOE-EMODIN； Glycyrrhiza uralensis； Glycosylation； Suspension cultured cells

DAI Jun-gui， Email： jgdai@imm.ac.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.010

十二五“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2012X 09301002-001-005）

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所（張德武、陶小宇、戴均貴），醫(yī)藥生物技術(shù)研究所（張德武、余利巖）

戴均貴，Email：jgdai@imm.ac.cn

2015-03-25

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù)， 2015， 10（3）：248-251

Author Affiliations： Institute of Materia Medica （ZHANG De-wu， TAO Xiao-yu， DAI Jun-gui）， Institute of Medicinal Biotechnology （ZHANG De-wu， YU Li-yan）， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol， 2015， 10（3）：248-251