栝樓薤白半夏湯對(duì)MIRI大鼠VEGF蛋白、基因表達(dá)及MVD影響的實(shí)驗(yàn)研究

楊 麗，張炳填*，湛錦源，肖秀琦，何 棟

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.湖南長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410007）

心肌缺血再灌注損傷 （myocardial ischermic reperfusion injure，MIRI） 的發(fā)病機(jī)制及防治是當(dāng)今備受關(guān)注的熱門課題，其中血管病變是缺血心肌病的根本原因。 栝樓薤白半夏湯 （Gualou Xiebai Banxia Decoction，GXBD） 出自張仲景的 《金匱要略》，是治療胸痹的名方，此方現(xiàn)在多用于心血管疾病的治療。 本課題前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GXBD 能保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、改善心肌細(xì)胞凋亡和對(duì)心肌細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的介導(dǎo)以保護(hù)缺血再灌注損傷心肌[1-3]。 本文通過(guò)觀察GXBD 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 蛋白與基因的表達(dá)、微血管密度（microvessel density，MVD）的影響，探討此方防治MIRI 的新機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

3月齡雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量220～250 g。由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（湘）2013-0004，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)清潔，自然采光，通風(fēng)良好。

1.2 藥物與試劑

栝樓薤白半夏湯[4]（栝樓30 g， 薤白15 g， 半夏10 g，白酒30 mL）。白酒購(gòu)自市售的米酒頭（酒精含量35%）。 7 劑藥材按照文獻(xiàn)[5]濃縮至含生藥1 g/mL，共385 mL，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩YBR Green PCR 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：Thermo 公司產(chǎn)品；一抗Rabbitanti-VEGF（批號(hào)：12320）；Rabbit-anti-CD34；二抗通用型PV-9000Kit 試劑盒，均為武漢搏士德生物公司產(chǎn)品。

1.3 儀器

RWD407 型小動(dòng)物人工呼吸機(jī)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），MP150 型16 導(dǎo)生理記錄儀（美國(guó)BIOPAC 公司），EICADMLB2 型光學(xué)顯微鏡（中國(guó)上海第三分析儀器廠制造），JY5002 型電子天平 （上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司）；PCR 儀器（德國(guó)Eppendorf 公司）；DYY-6C 電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 分組與給藥

將SD 雄性大鼠50 只，隨機(jī)分為5 組，每組10只（死亡后即剔除）。 分組情況如下： 假手術(shù)組（A組），模型組（B 組），缺血預(yù)處理組（C 組），栝樓薤白半夏湯低劑量預(yù)處理組（D 組），栝樓薤白半夏湯高劑量預(yù)處理組（E 組）。 A、B、C 組每天灌胃等量生理鹽水，D、E 組每天灌胃栝樓薤白半夏湯水煎液，劑量分別是4.6 g/kg、18.4 g/kg（藥物劑量按人鼠體表面積計(jì)算出大鼠的等效劑量），連續(xù)7 d。 末次灌胃1 h 后，各組分別行以下處理：A 組：在冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線不結(jié)扎；B、D、E 組：結(jié)扎30 min，再灌注90 min；C 組：缺血5 min，再灌注15 min，反復(fù)3次，立即重復(fù)B 組實(shí)驗(yàn)方法。

2.2 動(dòng)物造模

參照文獻(xiàn)[6]造心肌缺血再灌注損傷模型，以心電圖出現(xiàn)ST 段弓背樣抬高為結(jié)扎成功， 松開活結(jié)抽出墊線與穿線，恢復(fù)血流再灌，以抬高的ST 段緩慢下降1/2 為再灌注成功。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 VEGF 蛋白表達(dá) 術(shù)后取心肌組織，標(biāo)本經(jīng)4℅多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，用SABC 法切片脫蠟，滅活內(nèi)源性酶，熱修復(fù)抗原，滴加BSA 封閉液，后滴加稀釋的一抗（1∶100），PBS 洗后，滴加二抗，再用PBS 洗，后滴加DAB 顯色，水洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，封片。 結(jié)果陽(yáng)性表達(dá)的部位顯黃色或棕黃色，細(xì)胞核紫藍(lán)色，其他部位無(wú)色。 用Motic 顯微攝像儀及圖像分析軟件測(cè)量免疫組化染色的平均光密度值。

2.3.2 VEGF 基因（VEGF mRNA）表達(dá) 術(shù)后取心肌組織，標(biāo)本置于-80 ℃冰箱固定后，取組織于Trizol 的勻漿管中勻漿20 s 后于超凈臺(tái)中溫育5 min，12 000 r/min，離心10 min；吸上清液，加入氯仿，搖勻，室溫靜置2 min，于4 ℃、12 000 r/min 中離心10 min； 吸上清液加入異丙醇， 搖勻， 室溫靜置15 min，4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，棄上清；加入1 mL 75%的無(wú)水乙醇， 漂洗沉淀，4 ℃，12 000 r/min，離心5 min，棄上清；重復(fù)前1 次步驟后，室溫干燥10 min；加入40 μL 的DEPC 水溶解RNA，20 L 體系逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 VEGF 特異引物，長(zhǎng)度為20 bp，預(yù)期產(chǎn)物大小為187 bps。上游引物：5'-CCAAAGCCAGCACATAGG-3'， 下 游 引 物：5'-TCTCCGCTCTGAACAAGG-3'；GAPDH 引 物，長(zhǎng)度為20 bp， 預(yù)期產(chǎn)物大小為191 bps。 上游引物：5'-ATCACTGCCACCCAGAAG-3'， 下 游 引 物：5'-TCCACGACGGACACATTG-3'。 引物由上海捷瑞合成，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PCR （reverse transcription PCR，RT-PCR）試劑盒說(shuō)明，在PCR 儀上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。 攝片測(cè)其平均光密度值，計(jì)算VEGF mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

2.3.3 MVD 測(cè)定 選取左心室缺血區(qū)心肌組織，灌注固定，制作切片，行特異性免疫組化染色。40 倍光鏡下掃視整個(gè)切片，選擇5個(gè)梗死區(qū)周圍血管密度最高的區(qū)域。 在400 倍光鏡視野下計(jì)數(shù)毛細(xì)血管（MVC），單個(gè)的內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞簇、微小血管均予計(jì)數(shù)，管腔大于8個(gè)紅細(xì)胞大小、帶有肌層的血管均不予計(jì)數(shù)。 以MVC/mm2表示MVD。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料若符合正態(tài)分布，以“±s”表示，組間比較用單因素的方差分析，方差齊時(shí)每?jī)山M之間的比較用LSD 法， 方差不齊時(shí)采用Tamhane’s T2。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

各組MIRI 大鼠VEGF 蛋白、 基因表達(dá)與MVD的比較

與A 組比較，B、C、D、E 組VEGF 蛋白、 基因表達(dá)水平均升高 （P＜0.05 或P＜0.01），MVD 顯著升高（P＜0.01）； 與B 組比較，C、D、E 組VEGF 蛋白表達(dá)均有升高（P＜0.05 或P＜0.01），VEGF 基因、MVD 顯著升高（P＜0.01）；與C 組比較，D 組VEGF 蛋白、基因與MVD 明顯升高（P＜0.01），C、E 兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表1。 VEGF 蛋白表達(dá)見封三彩圖圖1。

表1 各組大鼠VEGF 蛋白、VEGF mRNA 表達(dá)、MVD 的比較 （±s，n=6）

表1 各組大鼠VEGF 蛋白、VEGF mRNA 表達(dá)、MVD 的比較 （±s，n=6）

注： 與A 組比較△P＜0.05，△△P＜0.01； 與B 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與C 組比較▲▲P＜0.01。

組別A 組B 組C 組D 組E 組VEGF 蛋白0.216±0.045 0.284±0.026△0.374±0.088△△*0.486±0.046△△**▲▲0.400±0.026△△**VEGF mRNA 0.237±0.078 0.315±0.052△0.531±0.038△△**0.825±0.059△△**▲▲0.571±0.037△△**MVD（mm2）3.60±1.140 7.80±0.837△△13.00±1.225△△**17.20±0.837△△**▲▲14.20±0.837△△**

4 討論

心肌缺血后，由于缺血、缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞水腫、充血、壞死、凋亡，心肌功能受損。 因此及時(shí)有效地恢復(fù)缺血心肌的血流灌注，對(duì)缺血心肌功能的恢復(fù)至關(guān)重要。 然而現(xiàn)代的再灌注手段溶栓、冠脈搭橋等雖在一定程度上能減輕心肌缺血，但也能引起血管內(nèi)皮功能受損、代謝功能障礙、心肌細(xì)胞頓抑等損害， 即MIRI。 現(xiàn)代研究證實(shí)缺血性預(yù)處理(Ischemic Preconditioning，IPC) 對(duì)MIRI 有保護(hù)作用[7]。若能給予一些外源性的藥物預(yù)處理， 起到類似IPC的作用，那么再灌注的效果會(huì)更好，且副作用小。 故本實(shí)驗(yàn)特設(shè)缺血預(yù)處理組（C 組）作為陽(yáng)性對(duì)照組。

血管新生是指在原有血管基礎(chǔ)上通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化以芽生或非芽生的形式生成新的血管。 有研究表明促血管新生后， 缺血區(qū)的MVD 增加，梗死面積減小，心肌細(xì)胞壞死和凋亡的程度降低，心功能得以改善，因而促缺血心肌血管新生已成為治療缺血性心臟病最具前景的方法之一[8]。 血管生成需要多種因子參與，其中VEGF 是主要的誘導(dǎo)因子，VEGF 的表達(dá)上調(diào)，就能促進(jìn)缺血心肌組織中新血管的生成[9]。 目前研究發(fā)現(xiàn)缺氧、缺血狀態(tài)下可以誘導(dǎo)VEGF 的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，B組心肌組織中VEGF 表達(dá)較A 組增加（P＜0.05）。 但這種內(nèi)生性的促血管生成物質(zhì)常常不足以盡快建立足夠豐富的側(cè)支血管來(lái)代償原有血供，缺血表現(xiàn)得不到糾正， 如果能進(jìn)行適當(dāng)?shù)耐緩浇o予外源性VEGF 或促進(jìn)其產(chǎn)生的藥物， 則可促使形成豐富的冠脈側(cè)支循環(huán)，滿足缺血心肌血供需求，糾正缺血狀態(tài)。 而在研究血管新生的指標(biāo)中，MVD 是反映血管新生強(qiáng)度的重要指標(biāo)[10]。故很多實(shí)驗(yàn)用MVD 來(lái)檢測(cè)血管新生的水平。 MVD 水平升高，表示血管新生活躍。

MIRI，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，一般將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”、“心痛”、“真心痛”的范疇，中醫(yī)藥在此病的治療上積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，張仲景之《金匱要略》對(duì)其治療有詳細(xì)記載，其中GXBD 是治療此病的主方。據(jù)現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究，GXBD 中的各藥都有保護(hù)MIRI 的作用[11-13]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：和B 組相比，C、D、E 組大鼠心肌組織中VEGF 蛋白及基因表達(dá)、MVD 均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）， 說(shuō)明通過(guò)缺血預(yù)處理、GXBD 預(yù)處理更能促進(jìn)VEGF 的蛋白與基因表達(dá)，形成了更豐富的新生血管，改善缺血，對(duì)心肌組織進(jìn)行保護(hù)。 與C 組比較，D 組大鼠心肌組織中VEGF 的蛋白與基因表達(dá)、MVD 明顯增加， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），C、E兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明GXBD 同缺血預(yù)處理一樣達(dá)到了保護(hù)MIRI 的作用， 且低劑量組優(yōu)于高劑量組。

綜上所述， 在MIRI 中，GXBD 通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)血管新生，最終達(dá)到預(yù)防和治療MIRI的作用。

致謝：湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所對(duì)本研究鼎力支持。

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