MCM2與Cx43蛋白在非霍奇金淋巴瘤中的表達和臨床意義

卿 蕊，范自力*，黃澤智，姜艷紅，肖 盛，楊 秦

（1.中南大學湘雅三醫院血液科，湖南 長沙410013；2.中南大學湘雅三醫院病理科，湖南 長沙410013；3.邵陽醫學高等專科學校檢驗系，湖南 邵陽422000）

非霍奇金淋巴瘤 （non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）是一組起源于血液淋巴系統的惡性腫瘤。因其臨床表現多樣、病理類型復雜、異質性明顯，嚴重危害人類健康而成為當前腫瘤研究的一個熱點。 微小染色體維持蛋白2（Minichromosome maintenance proteins 2，MCM2）是一種重要的DNA 復制啟動子[1]。 在DNA 復制的起始和延伸過程中起著重要作用。 細胞間隙連接蛋白43（Connexin 43，Cx43）是一種存在于細胞之間的通道蛋白，它負責細胞之間物質及信息的交換，對腫瘤的發生發展起著抑制調控作用[2]。 Ki-67是一種核蛋白抗原，是目前公認能反映細胞增殖活性的指標，可用于判斷淋巴瘤惡性程度及預后[3]。 本研究采用免疫組織化學方法（SP 法）檢測60 例NHL組織中MCM2、Cx43 蛋白的表達情況， 并分析其表達與臨床病理特征的關系，進一步探討它們與NHL發生發展機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2013年10月至2014年10月在中南大學湘雅三醫院手術切除并經病理證實為非霍奇金淋巴瘤患者組織標本60 例及反應性增生淋巴結患者（reactive hyperplasia of lymph node，RH）組織標本20 例。 所有標本均由本院兩位病理科高年資醫生行蠟塊切片復查， 所選標本病例診斷明確符合WHO[4]標準。 60 例NHL 患者中，男34 例，女26 例；年齡12～86 歲，中位年齡52.6 歲；惰性NHL（低度惡性）14 例，包括濾泡性淋巴瘤2 例、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤6 例、小淋巴細胞性淋巴瘤4 例、淋巴漿細胞淋巴瘤2 例；侵襲性NHL（中高度惡性）46 例，包括彌漫大B 細胞性淋巴瘤36 例、 漸變性大B 細胞性淋巴瘤2 例、 血管免疫母T 細胞淋巴瘤2 例、NK/T 細胞淋巴瘤2 例、外周T 細胞淋巴瘤4 例。 所有患者均為初治患者，均通過手術或影像檢查確定腫瘤侵犯部位。 采用Ann Arbor 分期系統[5]分期，按國際工作分型，經形態及免疫組化反應區分T、B 細胞亞型，按全身癥狀分組。

1.2 試劑與儀器

兔抗人MCM2 多克隆抗體（10513-1-AP）、兔抗人Cx43 多克隆抗體（15386-1-AP），稀釋倍數均為1∶50，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。二抗為快捷型酶標羊抗兔IgG 聚合物，DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司， 二甲苯、乙醇、3%H2O2、 枸櫞酸鈉等常規試劑購自北京化學試劑公司。 YD-315 切片機（浙江金華益迪試驗器材），BA2T 顯微鏡（Motic），BMJ-A 包埋機（常州中威電子儀器）。

1.3 實驗方法

蠟塊包埋標本連續切片4 μm， 防脫撈片，60 ℃烤片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，微波爐抗原修復，3% H2O2滅活內源性過氧化物酶，山羊血清封閉，加一抗4 ℃過夜孵育，PBS 液洗5 min×3 次，加二抗37 ℃孵育30 min，PBS 液洗5 min×3 次，DAB顯色1～5 min，蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木素復染胞核，鹽酸酒精分化，流動自來水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。以PBS液替代一抗作陰性對照，以正常淋巴結組織的陽性切片作陽性對照。

1.4 結果判定

MCM2 的陽性染色部位為細胞核，Cx43 的陽性染色部位為細胞膜、細胞質。 在染色均勻的區域，選取5個(上、下、左、右、中)高倍鏡視野（×400）：（1）按陽性細胞百分率（A 值）評分：1%～25%為1 分，25%～50%為2 分，＞50%為3 分；（2）按染色強度（B 值）評分：不著色為0 分，淺棕黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分。 綜合A+B 值判斷結果。 陰性（-）為0 分，弱陽性（+）為1～2 分，中度陽性（++）為3～4分，強陽性（+++）為5～6 分。

1.5 統計學分析

采用SPSS 18.0 版軟件進行處理。 組間率的比較用χ2檢驗計數資料分析， 相關性分析用Pearson等級相關分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NHL 和RH 組織中MCM2、Cx43 蛋白的表達

MCM2 為胞核表達，Cx43 為胞膜、胞質表達。 陽性染色均是棕黃（褐）色顆粒或團塊。 MCM2 在NHL中陽性表達率為86.67%（52/60）明顯高于在RH 組織中的25.00%（5/20），Cx43 在NHL 組織中的陽性表達率是20.00%(12/60) 明顯低于在RH 組織中的60.00%（12/20）， 比較差異均有統計學意義 （P＜0.01）。 見表1。

2.2 MCM2、Cx43 蛋白在NHL 中的表達與臨床病理特征的關系

NHL 中MCM2 的表達與惡性程度、 臨床分期、Ki-67 水平有關（P＜0.01 或P＜0.05），而與性別、年齡、全身癥狀、免疫分型無關（P＞0.05）；NHL 中Cx43 的表達與惡性程度有關（P＜0.01），而與性別、年齡、全身癥狀、免疫分型、臨床分期、Ki-67 水平無關（P＞0.05）。 見表2、封三彩圖1～2。 表明MCM2 的過度表達、Cx43 的低水平表達均與NHL 的惡性程度密切相關。

表1 MCM2、Cx-43 蛋白在NHL 和RH 組織中的表達 （例）

表2 MCM2、Cx43 蛋白表達與NHL 患者臨床病理特征的相互關系 （例）

60 例NHL 中MCM2、Cx43 蛋白的表達相關性無統計學意義（r=-0.05，P=0.80）。 可能由于本研究觀察樣本較少，觀察周期短等因素所致。

3 討論

腫瘤發生發展的核心環節是細胞異常增殖，而細胞增殖決定于細胞周期， 細胞周期受DNA 復制的調控， 所以檢測DNA 復制起始相關蛋白可預測腫瘤的發生。 MCM 家族就是DNA 復制起始調控蛋白之一。MCM2 是其家族的一員，它是近年來發現的一種能較好地反映細胞增殖活性程度的指標。 它在細胞處于分化成熟或靜止期含量較少， 而在增殖、轉化的細胞中，MCM2 含量從G0 期開始增加，到G1 末期和S 早期達到高峰，并與染色質結合，在S期至M 期成為游離的MCMC2，G2 期與M 期降低。由于這種與細胞增殖過程相一致的周期性變化，目前已將它視為S 細胞的標記物[6]，被認為是特異性增殖相關因子癌前標記[7]，是研究細胞能動性及評估腫瘤預后的較好指標。大量文獻報道，MCM2 在各種腫瘤細胞中高表達。 Mukherjce 等[8]采用免疫組化研究發現MCM2 陽性表達率與病理結果完全一致。Koto 等[9]研究表明MCM2 在食管鱗癌中的表達與淋巴轉移、病理分期、組織學分級等有關。 本研究發現，MCM2 在NHL 組織中陽性率表達顯著高達86.67%，而在RH 組織中陽性率僅為25%，且MCM2在NHL 中的陽性率隨著惡性程度、臨床分期及Ki-67 水平升高而升高， 說明MCM2 在癌細胞中的DNA 復制起點較多， 提示MCM2 高表達與NHL 發生密切相關。

細胞間隙連接通訊 （gap junction intercellular communication，GJIC） 是細胞間的重要連接方式，其基本結構單位是Cx，人類編碼Cx 基因有21 種，其中Cx43 是最廣泛最充足表達的間隙蛋白[10]，它在間隙連接介導的GJIC 方面發揮著重要作用。 近年來研究發現，Cx43 表達異常和GJIC 功能缺陷與多種腫瘤的惡性增殖和轉化密切相關， 表現為表達水平下調[11]。例如膠質瘤[12]、肺癌[13]、乳腺癌[14]、前列 腺癌[15]等普遍存在Cx43 的表達降低或缺失，但目前少見其與NHL關系的文獻報道。 本研究Cx43 在NHL 中的表達水平較RH 中的明顯降低，說明Cx43 的低表達與NHL癌變密切相關，可視為癌前病變的早期事件。

本研究發現二者無明顯相關，可能由于本研究觀察樣本較少，觀察周期短等因素，結果有待后續研究證實。 但前者為高表達而后者為低表達是明確的， 且MCM2 的過度表達與Cx43 的低水平表達與NHL 的惡性程度密切相關。

綜上所述，MCM2 蛋白在細胞增殖過程中起著關鍵作用，檢測NHL 組織中的MCM2 蛋白表達，能反映NHL 的惡性程度， 具有潛在的臨床應用價值；而Cx43 作為一種腫瘤抑制因子， 臨床檢測能作為NHL 預防的參考指標。 作為細胞周期重要的調控蛋白，MCM2 和Cx43 的聯合檢測，將有助于NHL 的早期診斷及預后的參考。 隨著后續研究的深入，MCM2有望成為NHL 治療上的新靶點。

[1]粟東海，趙全年，王 寧.微小染色體維持蛋白2在腫瘤中的研究現狀[J].醫學綜述，2010，16（19）：2 945-2 947.

[2]李 立，唐羅生.細胞間隙連接蛋白與腫瘤[J].國際眼科雜志，2007，7（1）：175-178.

[3]Sanche-Beato M，Saez AI，Navas IC，et al. Overall survival in aggressive B-cell lymphoma as is dependent on the accumulation of alterations in p53，p16，and p27 [J]. Am J Pathol，2001，159(1)：205-213.

[4]Vardiman JW. The World Health Organization (WHO) classification of tumors of the hematopoietic and lymphoid tissues：an overview with emphasis on the myeloid neoplasms [J]. Chem Biol Interact，2010，184(1-2)：16-20.

[5]王毓鑾，米振國.現代非霍奇金淋巴瘤[M].北京：人民軍醫出版社，2003：93-103.

[6]Gakiopoulou H，Korkolopoulou P，Levidou G，et al. Minichromosome maintenance protein 2 and 5 in non-benign epithelial ovarian tumours：relationship with cell cycle regulators and prognostic implications [J]. Br J Cancer，2007，97(8)：1 124-1 134.

[7]Alison MR，Hunt T，Forbes SJ. Minichromosome maintenance(MCM) proteins may be pre-cancer marks [J]. Gut，2002，50(3)：290-291.

[8]Mukherjee G，Muralidhar B，Bafna UD，et al. MCM immunocytochemistry as a first line cervical screening test in developing countries：a prospective cohort study in a regional cancer centre in India [J]. Br J Cancer，2007，96(7)：1 107-1 111.

[9]Kato H，Miyazaki T，Fukai Y，et al. A new proliferation marker，minichromosome maintenance protein 2，is associated with tumor aggressiveness in esophageal squamous cell carcinoma [J]. Surg Oncol，2003，84(1)：24-30.

[10]King TJ，Lampe PD. Temporal regulation of connexin phosphorylation in embryonic and adult tissues [J]. Biochim Biophys Acta，2005，1919(1-2)：24-35.

[11]Krutovskikh VA，Troyanovsky SM，Piccoli C，et al. Differential effect of subcellular localization of communication impairing gap junction protein connexin43 on tumor cell growth in vivo [J]. Oncogence，2000，19(4)：505.

[12]Herrero-Gonzalez S，Gangoso E，Giaume C，et al.Connexin-43 inhibits the oncogenic activity of C-Sre in C6 glioma cells [J].Oncogence，2010，29(42)：5 712-5 723.

[13]Jinn Y，Inese N. Connexin43，E-cadherin，beta-catenin and ZO-1 expression，and aberrant methylation of the connexin43 gene in NSCL [J]. Anticancer Res，2010，30(6)：2 271-2 278.

[14]Laird DW，Fistouris P，Batist G，et al. Deficiency of connexin43 gap junction is an independent marker for breast tumors[J]. Cancer Res，1999，56(16)：4 104-4 110.

[15]Benko G，Spajic B，Demirovic A，et al. Prognostic value of connexin43 expression in patients with clinically localized prostate cancer [J]. Prostate Cancer Prostatic Dis，2010，14(1)：90-95.