尼莫地平對脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠P38MAPK信號通路的調控作用

陳旭如，張佳彥

（1復旦大學附屬上海市第五人民醫院，上海200240；2上海市第八人民醫院，上海200235）

尼莫地平對脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠P38MAPK信號通路的調控作用

陳旭如1，張佳彥2

（1復旦大學附屬上海市第五人民醫院，上海200240；2上海市第八人民醫院，上海200235）

目的：研究尼莫地平對細菌內毒素脂多糖（LPS）誘導的急性肺損傷（ALI）的保護作用及其對P38MAPK信號通路的調控作用.方法：用LPS誘導免疫炎癥損傷來建立ALI動物模型.40只健康昆明小鼠分成對照組（n＝8）、LPS模型組（n＝16）和尼莫地平干預組（n＝16）.除對照組外，其余小鼠腹腔注射LPS（5 mg／kg）；尼莫地平干預組在注射LPS 0.5 h前注射尼莫地平（20 mg／kg）；對照組注射等量生理鹽水.藥物注射完畢后1 h、3 h各取每組中的半數處死取肺組織，HE染色觀測病理改變，ELISA檢測血清中炎癥因子變化，Western Blotting方法檢測其肺組織絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、MKK3／6、活化轉錄因子ATF?2表達變化.結果：實驗結果發現尼莫地平干預組能夠減輕肺病理損傷，降低血清中炎癥因子TNF?α和 IL?1β含量，抑制小鼠肺組織中的 p?P38MAPK、p?PMKK3／6、p?ATF?2的表達量.結論：尼莫地平能減輕LPS誘導的肺組織損傷，主要通過抑制P38MAPK信號通路的激活，減少炎癥因子的產生，從而發揮對ALI的保護作用.

尼莫地平；急性肺損傷；炎癥因子；P38MAPK信號通路

0　引言

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是各種肺內、肺外因素引起的肺泡上皮細胞以及毛細血管內皮細胞損傷所導致的一種急性進行性呼吸衰竭［1］.其病理特點為：肺泡上皮和毛細血管細胞發生廣泛性的損傷，導致肺泡毛細血管通透性增加，進而出現血漿蛋白漏出，形成富含蛋白質的肺透明膜，最終出現炎性細胞浸潤，形成了肺部水腫和微血栓［2］.最終臨床表現為嚴重的低氧血癥和持續加重的進行性呼吸困難.

目前對于該病的治療主要以機械通氣為主，輔以藥物治療，但治療策略極為有限.近年來對該病的研究很多，但臨床發病率及死亡率仍居高不下，因此進一步研究其發病機制及治療措施極為必要.在臨床上，與膿毒癥合并的ALI發病率較高，而膿毒癥感染的常見原因之一是革蘭陰性桿菌感染.革蘭陰性細菌細胞壁外膜的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是主要的致病因素［3］，因此可利用LPS誘導ALI模型，探討ALI的發病機制及其治療措施.

尼莫地平在臨床上用于預防蛛網膜下隙出血后的血管痙攣，近年研究發現尼莫地平可調節免疫和細胞增殖，因此本研究利用腹腔注射LPS建立小鼠免疫炎癥模型，從免疫調節出發，考察尼莫地平是否對LPS誘導的ALI具有保護作用，以及其可能的作用機制，是否通過調控P38MAPK信號通路發揮保護作用，以期為臨床用藥提供實驗依據.

1　材料和方法

1.1實驗試劑 尼莫地平（Nimodipine，上海博蘊生物科技有限公司）；LPS（E.coli serotype 055：B5，Sigma公司）；絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）、活化轉錄因子（ATF?2）、MKK3／6和β?actin抗體（Bioworld Company）.

1.2實驗動物模型制作健康昆明小鼠40只，雄性，體質量35～40 g，將小鼠分籠喂養于室溫控制在25±2℃的室內，自由進食進水，12 h光照.動物適應5 d后開始實驗.將動物分成對照組（n＝8）、LPS模型組（n＝16）和尼莫地平干預組（n＝16）.LPS模型組和尼莫地平干預組小鼠腹腔注射LPS（5 mg／kg）；尼莫地平干預組在注射LPS 0.5 h前注射尼莫地平，劑量為20 mg／kg；對照組腹腔給予等量的生理鹽水.脂多糖注射1、3 h后各取每組中的半數動物處死，取肺組織.

2　標本處理及指標測定

2.1血清收集 4%水合氯醛麻醉小鼠后，剪除小鼠胡須，采用眼球取血法收集血液約1 mL.在4℃冰箱靜置過夜，2000 g離心10 min后取上清，放置－80℃保存備用.

2.2肺組織收集 分離右肺葉，右肺上葉用4%多聚甲醛固定，蘇木素?伊紅（htoxylin eosin，HE）染色進行病理學檢測.右肺中葉快速置于液氮中凍存，用于肺組織免疫印跡分析（Western Blot）檢測.取右肺下葉用于肺組織濕干重比（W／D）的測量.

2.3HE病理染色 肺組織在4%多聚甲醛中固定，組織蠟塊包埋后切片，厚度為5 μm.將組織切片進行HE染色，中性樹膠封片.

2.4ELISA法測血清中細胞因子水平 血清中細胞因子TNF?α和IL?1β的含量根據酶聯免疫試劑盒的說明書逐步進行.

2.5肺組織濕干重（W／D）比值測定 取右肺下葉用于肺組織濕干重比測量.首先用吸水紙將肺組織表面的水漬吸干后再行稱重，此為肺組織濕重.之后置于80℃烘箱中烘烤24 h，再次稱量得到肺組織的干重，濕重／干重的比值即為肺組織的濕干重比.

2.6Western Blot法檢測肺組織P38MAPK信號通路各蛋白表達 將提取的肺組織用0.9%的生理鹽水研磨成組織勻漿，離心后取其上清液，利用bicincho?ninic acid（BCA）法測蛋白濃度.電泳每孔上樣量為50 μg，經轉膜、一抗、二抗孵育后，加入BeyoECL Plus混合發光液，用Clinx Science Instrucment成像系統采集圖像.利用Image J軟件進行半定量分析，目的蛋白與β?actin條帶的灰度值之比即為目的蛋白的相對表達量.

3　結果

3.1各組小鼠肺組織病理學變化 HE染色后利用光學顯微鏡觀察，發現正常組小鼠肺組織結構完整清晰，肺泡壁比較薄，沒有炎性細胞滲出（圖1A），而LPS模型組小鼠的肺組織可見到肺泡壁增厚的現象，中性粒細胞滲出，富含蛋白質的水腫液滲出，微血栓形成，透明膜形成（圖1B），尼莫地平干預組小鼠肺組織結構破壞較模型組明顯減輕，與正常組相比肺泡壁略增厚，較模型組相比中性粒細胞滲出減少，富含蛋白質的水腫液滲出減少，有少量紅細胞滲出（圖1C）.

圖1　肺組織病理學變化

3.2各組小鼠肺組織濕干重比（W／D） 如圖2所示，LPS模型組小鼠的肺組織濕干重比較對照組明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.01），而尼莫地平干預組較模型組明顯降低（P＜0.01），其中1 h和3 h的作用時間點差異不明顯.

圖2　肺組織濕干重比變化

3.3各組小鼠血清中TNF?α水平 圖3顯示了尼莫地平對LPS誘導炎癥小鼠血清中TNF?α的影響.LPS組在注射LPS 1 h和3 h后TNF?α含量顯著性升高，與正常對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01），而尼莫地平干預組在注射尼莫地平后較LPS組TNF?α顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.01）.

圖3　尼莫地平對LPS誘導炎癥小鼠血清中TNF?α的影響

3.4各組小鼠血清中IL?1β水平 尼莫地平對LPS誘導炎癥小鼠血清中IL?1β的影響如圖4所示：LPS組在注射LPS1 h和3 h后IL?1β含量顯著性升高，與正常對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01），而尼莫地平干預組在注射尼莫地平后IL?1β含量顯著下降，與LPS組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）.

圖4　尼莫地平對LPS誘導炎癥小鼠血清中IL?1β的影

3.5P38MAPK蛋白磷酸化水平 如圖5所示，LPS模型組小鼠肺組織P38MAPK蛋白磷酸化水平較對照組升高，組間差異有統計學意義（P＜0.01），尼莫地平干預后發現肺組織的P38MAPK蛋白磷酸化水平，相對于模型組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）.

圖5　尼莫地平對LPS誘導炎癥小鼠肺組織P38MAPK蛋白表達的影響

3.6MKK3／6蛋白磷酸化水平 LPS模型組小鼠肺組織MKK3／6蛋白磷酸化水平，與正常對照組相比升高，而尼莫地平干預后該蛋白的磷酸化水平較模型組明顯降低（圖6），組間差異有統計學意義（P＜0.01），

圖6　尼莫地平對LPS誘導炎癥小鼠肺組織MKK3／6蛋白表達的影響

3.7肺組織核轉錄因子ATF?2表達 如圖7所示，LPS模型組肺組織ATF?2蛋白磷酸化水平較對照組升高，組間差異有統計學意義（P＜0.01），尼莫地平干預組較模型組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）.

圖7　尼莫地平對LPS誘導炎癥小鼠肺組織ATF?2蛋白表達的影響

4　討論

炎癥反應是維持組織穩態、預防感染的重要保護措施，但失控的炎癥反應可導致機體組織發生損傷［4］.ALI是全身炎癥反應在肺部的表現，也是機體內正常炎癥反應過度表達造成的結果［5］.在LPS誘導的ALI氣道炎癥反應中，LPS通過巨噬細胞膜表面上的Toll樣受體4（toll?like receptor 4，TLR4）激活巨噬細胞［6－7］.巨噬細胞一旦被激活，將會釋放多種細胞因子，其中最主要的是TNF?α和IL?1β.此類細胞因子的產生不僅可放大炎癥反應，同時可以導致肺組織在內的靶器官中多種效應細胞的活化，募集并釋放活性氧代謝產物和蛋白酶，引起細胞損害［8］.在ALI的發病中，這些炎性細胞、炎癥介質以及細胞因子的廣泛參與起到關鍵性作用.

LPS通過與TLR4結合可以激活下游信號通路，將細胞外刺激信號傳導至細胞內［9］.絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinases，MAPKs）信號通路與LPS引起的TLR4信號通路激活有關［10］.研究表明MAPKs在炎癥和氧化應激的細胞內信號傳導中發揮重要作用［11］，包括細胞外調節蛋白激酶（extracellular signal?regulated kinas，ERK）信號通路、P38MAPK信號通路、JNK／SAPK通路.各種應激、細胞生長因子和炎性細胞因子均可激活P38MAPK信號［12］.P38 MAPK由MAP激酶（MKK）3／6選擇性地激活，同時MAPK信號通路可以激活下游的信號蛋白，將刺激信號傳導至核內，活化核內蛋白轉錄活化因子（ATF）?2、c?jun、c?fos等，這些因子可以調節其與轉錄因子活化蛋白的結合，進而影響DNA的轉錄活性［13－14］.

本研究利用LPS腹腔注射建立ALI模型，誘導小鼠出現炎癥性肺損傷.癥狀與文獻報道相一致，肺組織切片利用HE染色進行觀測，發現有ALI的基本特征，如中性粒細胞聚集、血管內皮細胞和肺泡上皮細胞破壞、肺水腫現象，符合ALI疾病特點.ELISA實驗結果發現血清中細胞因子含量、肺W／D比均顯著增高，與正常對照組相比均有統計學意義.蛋白印跡實驗發現P38MAPK信號通路蛋白磷酸化水平在LPS模型組中表達升高，說明該通路被激活.應用尼莫地平干預后，肺損傷明顯減輕，炎癥因子釋放減少，蛋白磷酸化水平下降，說明抑制了P38MAPK信號通路的激活.由于LPS誘導的巨噬細胞活化主要由核內蛋白轉錄活化因子調控的炎癥反應來調節，所以我們通過測量其水平檢測核轉錄因子是否被尼莫地平抑制.在本研究中尼莫地平有效抑制了ATF?2的活化.

終上所述，尼莫地平應用于LPS誘導的ALI后，可降低血清中的炎性細胞因子，減輕肺組織炎癥損傷，抑制P38MAPK信號通路蛋白以及核轉錄因子的磷酸化，因此尼莫地平可能通過P38MAPK信號通路來發揮對LPS誘導的ALI的保護作用.

［1］Silva PL，Rocco PR，Pelosi P.FG?4497：a new target for acute respiratory distress syndrome？［J］.Expert Rev Respir Med，2015，9（4）：405－409.

［2］Hoeboer SH，Groeneveld AB，van der Heijden M，et al.Serial inflammatory biomarkers of the severity，course and outcome of late onset acute respiratory distress syndrome in critically ill patients with or at risk for the syndrome after new?onset fever［J］.Biomark Med，2015，9（6）：605－616.

［3］Xu Y，Zhang R，Li C，et al.Dexmedetomidine attenuates acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mouse through inhibition of MAPK pathway［J］.Fundam Clin Pharmacol，2015，29（5）：462－471.

［4］Bhargava M，Wendt CH.Biomarkers in acute lung injury［J］.Transl Res，2012，159（4）：205－217.

［5］El Kebir D，Gjorstrup P，Filep JG.Resolvin E1 promotes phagocyto?sis?induced neutrophil apoptosis and accelerates resolution of pulmo?nary inflammation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（37）：14983－14988.

［6］Zhang X，Li C，Li J，et al.Protective effects of protocatechuic acid on acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice via p38MAPK and NF?κB signal pathways［J］.Int Immunopharmacol，2015，26（1）：229－236.

［7］Feng G，Sun B，Li TZ.Daidzein attenuates lipopolysaccharide?induced acute lung injury via toll?like receptor 4／NF?kappaB pathway［J］.Int Immunopharmacol，2015，26（2）：392－400.

［8］He Z，Gao Y，Deng Y，et al.Lipopolysaccharide induces lung fibroblast proliferation through Toll?like receptor 4 signaling and the phosphoinositide3?kinase?Akt pathway［J］.PLoS One，2012，7（4）：e35926.

［9］Zhang Z，Chen N，Liu JB，et al.Protective effect of resveratrol against acute lung injury induced by lipopolysaccharide via inhibiting the myd 88?dependent toll?like receptor 4 signaling pathway［J］.Mol Med Rep，2014，10（1）：101－106.

［10］Wu J，Zhang YY，Guo L，et al.Bupleurum polysaccharides attenuates lipopolysaccharide?induced inflammation via modulating Toll?like receptor 4 signaling［J］.PLoS One，2013，8（10）：e78051.

［11］Runchel C，Matsuzawa A，Ichijo H.Mitogen?activated protein kinases in mammalian oxidative stress responses［J］.Antioxid Redox Signal，2011，15（1）：205－218.

［12］Wang F，Meng Y，Zhang Y，et al.Ketamine reduces lipopolysaccha?ride?induced high?mobility group box?1 through heme oxygenase?1 and nuclear factor erythroid 2?related factor 2／p38 mitogen?activated protein kinase［J］.J Surg Res，2015，194（2）：599－613.

［13］Wei L，Matsumoto H，Yamaguchi H.Propofol attenuates lipopo?lysaccharide?induced monocyte chemoattractant protein?1 production through p38 MAPK and SAPK／JNK in alveolar epithelial cells［J］.J Anesth，2013，27（3）：366－373.

［14］Pei YH，Cai XM，Chen J，et al.The role of p38 MAPK in acute paraquat?induced lung injury in rats［J］.Inhal Toxicol，2014，26（14）：880－884.

RegulatingeffectsofNimodipineonthe P38MAPK signaling pathways in lung tissue of ALI mice induced by lipopolysaccharide

CHEN Xu?Ru，ZHANG Jia?Yan
The Fifth People's Hospital of Shanghai，Fudan University，Shanghai 200240，China；The Eighth People's Hospital of Shanghai，Shanghai 200235，China

AIM：To study the protective effects of nimodipine on the acute lung injury（ALI）induced by the bacterial endotoxin lipopolysaccharide（LPS）and its regulation on the P38MAPK signaling pathways.METHODS：ALI animal model was built by intraperitoneal injection of LPS to induced inflammatory immune injury.Forty healthy mice were divided into three groups：control group（n＝8），LPS model group（n＝16）and Nimodipine group（n＝16）.Mice were intraperitoneally injected with LPS（5 mg／kg）except control group mice.Nimodipine group mice were given nimodipine（20 mg／kg）half hour before LPS treatment.Control group mice were given equal saline.The lung tissue was collected after 1 h and 3 h of LPS treatment.HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue.TNF?α and IL?1β in the serum were measured by ELISA；MKK3／6，p38MAPK，ATF?2 and its phosphorylation were evaluated by Western blotting.RESULTS：The results showed that Nimodipine could reduce lung injury，decrease TNF?α and IL?1β in serum，and inhibit phosphorylation of P38MAPK，MKK3／6 and ATF?2.CONCLU?SION：Nimodipine could alleviate the LPS?induced inflammatory injury，probably associating with decrease of inflammatory factors level in serum and inhibition of P38MAPK activation in lung tissue.

Nimodipine；acute lung injury；inflammatory factors；P38MAPK signal pathways

R644

A

2095?6894（2015）10?001?04

2015－07－20；接受日期：2015－08－08

陳旭如.本科，住院醫師.研究方向：呼吸內科.Tel：021?64308151－8499 E?mail：cxr1128＠163.com

張佳彥.E?mail：zjy＿wayne＠163.com