球囊霉素相關土壤蛋白提取條件的優化

何開平，杜鵬，吳強盛 （長江大學園藝園林學院，湖北 荊州434025）

球囊霉素 （glomalin）是叢枝菌根真菌 （arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）侵染植物根系后由根外菌絲或孢子釋放的一類特殊糖蛋白，在陸地生態系統中具有重要的功能［1］。目前，對土壤中球囊霉素的測定主要是通過考馬斯亮藍法和叢枝菌根真菌單克隆抗體MAb32B11進行酶聯免疫 （ELISA）反應［2］。研究發現，采用考馬斯亮藍法測定球囊霉素時，高溫提取并不能破壞除球囊霉素以外的所有非熱穩態土壤蛋白。因此，Rillig［2］建議使用球囊霉素相關土壤蛋白 （glomalin－related soil protein，GRSP）這個術語代替球囊霉素。AMF菌絲釋放的GRSP進入土壤后，具有膠結功能，可與沙土、黏土以及有機物質結合，促進團聚體的形成和穩定團聚體的結構，且這種功能要明顯高于根系菌根侵染率和土壤菌絲對團聚體穩定的效應［3，4］。GRSP也能延緩土壤中碳的降解［5］，能夠固持重金屬污染的土壤中的重金屬［6］，調節土壤／植物中的水分狀況［7］。

Wu等［4］最近將GRSP分為2種類型，易提取球囊霉素相關土壤蛋白 （EE－GRSP）和難提取球囊霉素相關土壤蛋白 （DE－GRSP），但是這2種物質的提取技術還待商榷，一些提取的過程都不同程度地影響著EE－GRSP和DE－GRSP提取量。柑橘是我國南方重要的果樹，在農業生產、農民增收中具有重要作用。許多研究工作已經證實GRSP對柑橘園土壤的團聚體穩定性和土壤肥力產生效應［4，7］。

鑒于此，本研究擬對柑橘園土壤中EE－GRSP和DE－GRSP的提取方法進行優化，為今后進一步研究GRSP在柑橘園土壤中的作用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2013年4月21日，在長江大學柑橘園26年生枳砧溫州蜜柑根圍收集土樣。隨機選擇8棵生長健壯的植株，在距離植株根莖大約1m處，于表層5cm深處取土樣，每棵樹取土約1kg，帶回實驗室自然風干，過4mm篩備用。

1.2 試驗方法

EE－GRSP的提取參考文獻 ［1］從3個不同因素考慮：土樣重量、高溫滅菌時間和離心時間。在試驗過程中分別選取上一次最優的試驗結果作為下一次的提取條件。

土樣重量：稱取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25g的過篩土樣，按照常規提取比例（1∶8）分別加入2、4、6、8、10mL 20mmol／L檸檬酸緩沖液 （pH 7.0），121℃滅菌0.5h，10000r／min離心3min，將上清液轉入10mL離心管，待測。此過程共5個處理，每個處理重復4次。

高溫滅菌時間：取上一次試驗結果最佳的土樣重量，加入相應體積的20mmol／L檸檬酸緩沖液（pH 7.0），分別于121℃下滅菌0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0h。滅菌后，然后10000r／min離心5min，以空白為對照，以牛血清白蛋白為標準曲線，采用考馬斯亮藍染色法［8］于595nm波長下測定其光密度。此過程共10個處理，每個處理重復4次。

離心時間：在高溫滅菌最佳時間的基礎上，進行離心時間的處理，分別離心5、10、15、20、25min，取上清液測定其吸光值。共5個處理，每個處理重復4次。

DE－GRSP的提取參考文獻 ［4］離心時間的設計進行：EE－GRSP離心后的沉淀使用8mL 50mmol／L檸檬酸緩沖液 （pH 8.0）高壓滅菌1h，然后分別10000r／min離心5、10、15、20、25min，取上清液，測定其光密度。此過程共5個處理，每個處理重復4次。

1.3 數據處理

運用SAS 8.1軟件的ANOVA過程對處理間作差異性的測驗，采用Duncan法進行多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 土樣重量對EE－GRSP提取量的影響

圖1所示為不同土樣重量對EE－GRSP提取量的影響。結果顯示，在0.25～0.75g土壤重量范圍內，EE－GRSP的提取量隨著土樣重量的增加而逐漸升高，且在0.75g時EE－GRSP的提取量最高，達到1.41mg／g。隨著土壤重量的繼續增加，EE－GRSP的提取量又逐漸下降，而后從1.0～1.25g時EE－GRSP的提取量又顯著地升高。因此，當土樣重量為0.75mg／g時提取效果最好。因此，土樣重量為0.75g為后續試驗的一個最佳條件。

2.2 高溫滅菌時間對EE－GRSP提取量的影響

圖2顯示，在土樣重量相同的情況下，不同的高溫滅菌時間顯著地影響了EE－GRSP的提取量，呈現出波浪狀起伏變化。高溫滅菌提取1h所測得的EE－GRSP值最高，當高溫滅菌時間為1.5h時，EE－GRSP的提取量迅速降低，最低時下降了38.2%。而后隨著滅菌時間的增加，EE－GRSP的提取量表現出升高、降低以及再升高的趨勢。因此，在土樣重量為0.75g時，高溫滅菌提取1h時所得到的EE－GRSP含量最高。

圖1 土樣重量對柑橘根際EE－GRSP含量的影響

圖2 高溫滅菌時間對柑橘根際EE－GRSP含量的影響

2.3 離心時間對 EE－GRSP和 DE－GRSP提取量的影響

圖3表明不同的離心時間對土樣中EEGRSP的提取量有顯著的影響。離心時間從5min到20min范圍內，EE－GRSP的提取量隨著離心時間的增加而增加，在離心時間為20min時，EE－GRSP提取量達到最高。當離心時間繼續增加時，EE－GRSP的提取量顯著降低。從圖3還可以看出，相比較于離心時間為20min而言，EE－GRSP的提取量降低了79.8%。

圖4顯示不同離心時間對DE－GRSP提取量的影響。當離心時間為5min時，DE－GRSP提取量最低；離心10min時DE－GRSP的提取量最高，為0.58mg／g，但隨著離心時間的繼續增加，DE－GRSP的含量顯著降低，且在15～25min范圍內DE－GRSP的提取量無顯著地變化。

圖3 離心時間對柑橘根際EE－GRSP含量的影響

圖4 離心時間對柑橘根際DE－GRSP含量的影響

3 討論與小結

前人對GRSP的提取都是按照 Wright等［1］描述的方法進行，即土樣重量 （g）與緩沖液的體積（mL）的比例為1∶8。他們認為，即使土樣重量不同，加入的緩沖液體積不同，只要提取比例一樣，所提取出的GRSP含量是沒有差異的。然而，本研究分別稱取了不同重量的土樣，然后按照相同的提取比例加入相應的緩沖液，結果顯示在同一提取比例下，不同的土樣重量所提取的EE－GRSP含量有顯著地差異。當土樣重量為0.75g時所提取出來的EE－GRSP含量達到最高，說明在固定的1∶8提取比例下，當檸檬酸緩沖液為6mL、土樣質量為0.75g時，高溫提取能使土壤中的EE－GRSP釋放量達到最大。

本研究顯示，在EE－GRSP的提取過程中，不同的滅菌時間對EE－GRSP的提取有一定的影響，在高溫滅菌1h所提取出來的EE－GRSP含量最高，暗示土壤滅菌過程中高溫的時間延長可能使土壤有機質結合的GRSP釋放更徹底。但是隨著高溫時間的延長 （超過1h），反而導致EE－GRSP含量的下降，進一步暗示了EE－GRSP可能不能忍受長時間的高溫處理，導致大量降解。

本研究結果也表明，土壤樣品為0.75g與檸檬酸緩沖液為6mL混合，高溫滅菌后，分別離心5、10、15、20min和25min，發現在5～20min內，隨著離心時間的不斷升高，所提取的EE－GRSP含量呈現上升的趨勢，在離心時間為20min時達到最大；對于DE－GRSP而言，則在離心時間為10min時達到最大。謝小林等［9］發現離心力大小顯著影響了土壤顆粒的分離，離心力越大可分離更多更細的土壤微粒，從而對GRSP定量測定的干擾就越少。因此，建議在提取GRSP時，應加大離心力或者適當增加離心時間，以便從土壤中分離到純度更高的GRSP成分。

簡而言之，對土壤中EE－GRSP的提取中，建議宜稱取0.75g土樣，加入6mL 20mmol／L檸檬酸緩沖液 （pH 7.0），高溫滅菌1h，然后10000r／min離心20min，DE－GRSP采用10000r／min離心10min。采用上述過程，可以較準確地測定土壤中GRSP含量，減少實驗過程造成的誤差。不同類型的土壤在進行GRSP的提取過程中還需要進一步地校正。

［1］ Wright S F，Upadhyaya A.Extraction of an abundant and unusual protein from soil and comparison with hyphal protein of arbuscular mycorrhizal fungi［J］.Soil Science，1996，161：575～586.

［2］ Rillig M C.Arbuscular mycorrhizae，glomalin，and soil aggregation ［J］.Canadian Journal of Soil Science，2004，84：355～363.

［3］ 彭思利，申鴻，袁俊吉，等.叢枝菌根真菌對中性紫色土土壤團聚體特征的影響 ［J］.生態學報，2011，31（2）：498～505.

［4］ Wu Q S，Cao M Q，Zou Y N，et al.Direct and indirect effects of glomalin，mycorrhizal hyphae，and roots on aggregate stability in rhizosphere of trifoliate orange ［J］.Scientific Reports，2014，4：5823.

［5］ Rillig M C，Wright S F，Allen M F，et al.Rise in carbon dioxide changes soil structure ［J］.Nature，1999，400：628.

［6］ Cornejo P，Meier S，Borie G，et al.Glomalin－related soil protein in a Mediterranean ecosystem affected by a copper smelter and its contribution to Cu and Zn sequestration ［J］.Science of the Total Environment，2008，406：154～160.

［7］ Zou Y N，Srivastava A K，Wu Q S，et al.Glomalin－related soil protein and water relations in mycorrhizal citrus（Citrus tangerina）during soil water deficit ［J］.Archives of Agronomy and Soil Science，2014，60：1103～1114.

［8］ Koidea R T，Peoplesa M S.Behavior of Bradford－reactive substances is consistent with predictions for glomalin ［J］.Applied Soil E－cology，2013，63：8～14.

［9］ 謝小林，許朋陽，朱紅惠，等.球囊霉素相關土壤蛋白的提取條件 ［J］.菌物學報，2011，30（1）：92～99.