呋柳擦劑微生物限度檢查方法研究

楊靜??尹娜娜??苗愛東

[摘要] 目的 建立呋柳擦劑的微生物限度檢查方法。 方法 制備供試液時加入了聚山梨酯80，并與未加聚山梨酯80供試液的驗證結果相比較。 結果 未加聚山梨酯80的供試液存在抑菌活性，而加入15g聚山梨酯80的供試液，采用培養基稀釋法各試驗菌的回收率均>70%。 結論 呋柳擦劑可采用加入聚山梨酯80的供試液制備方法進行微生物限度檢查。

[關鍵詞] 呋柳擦劑；聚山梨酯80；微生物限度檢查；方法驗證

[中圖分類號] R927.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）17-48-03

Research on test methods of microorganism limit of Fu Liu liniment

YANG Jing YIN Nana MIAO Aidong

Beijing Military Region Joint Logistics Department Drug and Instrument Test Institute，Beijing 100071，China

[Abstract] Objective Establish microorganism limit test of Fu Liu Liniment. Methods Add Polysorbate 80 when preparing test solution，and compare the test result with the test solution without Polysorbate 80. Results Antibacterial activities appeared in the test solution without Polysorbate 80，but for the one with 15g Polysorbate 80，the recovery rate of every tested microorganisms is larger than 70%. Conclution We can conduct microorganism limit test of Fu Liu Liniment by adding Polysorbate 80.

[Key words] Fu Liu liniment；Polysorbate 80；Microorganism limit test；Method validation

呋柳擦劑為皮膚病外用制劑，由水楊酸、苯甲酸、鞣酸和呋喃西林等成分組成，本品具有抑制真菌、止癢等作用，主要用于手足癬和體癬等各種皮膚癬癥的治療。按常規方法制備供試液時，制劑中的主要化學成分存在明顯的抑菌活性，難以確保試驗結果的可靠性[1-5]。供試品加入15g聚山梨酯80混勻后再加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液制備的供試液為澄清的液體，采用培養基稀釋法各試驗菌的回收率均大于70%。現將結果報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HTY-2000 集菌儀（杭州泰林醫療器械廠）；GH-6000隔水式培養箱（天津泰斯特儀器有限公司）；LRH-250-MS霉菌培養箱（韶關泰宏醫療器械有限公司）；DF3-3紅外線高溫干燥箱（北京興爭儀器設備廠）；LDZX立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）。

1.2 菌種

驗證用試驗菌種均購于中國藥品生物制品檢定所，包括：大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]；白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。

1.3 培養基

玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁瓊脂培養基、改良馬丁培養基、膽鹽乳糖培養基、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號分別為1312192、131218、131016、120113、1309122、140110、140124）均購于中國藥品生物制品檢定所；聚山梨酯80（上海申宇醫藥化工有限公司）；呋柳擦劑（批號：20120917、20130312、20130313）。

2 試驗方法與結果

按照《中國藥典》2010年版，第一部[4]附錄XⅢ C微生物限度檢查法進行驗證試驗。

2.1 菌液制備

2.1.1 將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌，分別接種至10mL營養肉湯培養基中，35℃培養24h，分別取上述培養物1mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，制成每1mL含菌數約為50～100cfu的菌液，備用。用于控制菌檢查時，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，制成每1mL含菌數約為10～100cfu的菌液，備用。

2.1.2 將白色念珠菌接種至10mL改良馬丁培養基中，25℃培養24h，取上述培養物1mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，制成每1mL含菌數約為50～100cfu的菌液，備用。

表1 常規法的回收率試驗結果（%）

組別 大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌 枯草芽胞桿菌 白色念珠菌 黑曲霉

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

A組 61 60 64 23 24 26 0 0 0 92 91 90 87 90 85

B組 98 90 93 100 103 99 28 29 26 92 93 95 90 93 92

C組 98 100 102 100 100 96 98 96 100 100 99 100 95 100 100

表2 培養基稀釋法的回收率試驗結果（%）

組別 大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌 枯草芽胞菌 白色念珠菌

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

A組 96 90 94 23 25 26 0 0 0

57 55 60 0 0 0

B組 88 80 86

2.1.3 將黑曲霉的新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，25℃培養5～7d，有大量的孢子產生，加入5mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管中，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，制成含菌數約為50～100cfu/mL的孢子懸液，備用。

2.2 供試液的制備

A組：取呋柳擦劑10mL，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，搖勻，制成1∶10的供試液；B組：取呋柳擦劑10mL，加入15g聚山梨酯80混勻后再加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，搖勻，制成1∶10的供試液；C組：取15g聚山梨酯80加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，搖勻，作為稀釋劑對照組。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證

2.3.1 試驗組 （1）常規法：取1mL供試液和50～100cfu試驗菌，注入平皿中，每皿加15～20mL營養瓊脂培養基，搖勻、培養、觀察結果。（2）培養基稀釋法：分別取0.5和0.2mL的供試液和50～100cfu試驗菌，注入平皿中，每皿加15～20mL 營養瓊脂培養基，搖勻、培養、觀察結果。各試驗菌株的回收率結果，見表l。

2.3.2 菌液組 取50～100cfu試驗菌，注入平皿中，每皿加15～20mL營養瓊脂培養基，搖勻、培養、觀察結果。

2.3.3 供試品對照組 （1）常規法：取1mL供試液，注入平皿中，每皿加15～20mL營養瓊脂培養基，搖勻、培養、觀察結果。（2）培養基稀釋法：分別取0.5和0.2mL的供試液，注入平皿中，每皿加15～20mL 營養瓊脂培養基，搖勻、培養、觀察結果。

2.3.4 稀釋劑對照組 （1）常規法：取1Ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液和50～100cfu試驗菌，注入平皿中，每皿加15～20mL營養瓊脂培養基，搖勻、培養、觀察結果。（2）培養基稀釋法：分別取0.5和0.2mL的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液和50～100cfu試驗菌，注入平皿中，每皿加15～20mL l營養瓊脂培養基，搖勻、培養、觀察結果。

2.3.5 試驗組回收率（%）=[（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/菌液組平均菌落數]×100%。

從表1的回收率試驗結果可以看出：采用常規法，A組對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的回收率均<70%，對枯草芽胞桿菌的回收率為0，說明制劑中的成分有顯著的抑菌作用。B組僅對枯草芽胞桿菌的回收率<70%，因此，先選擇培養基稀釋法測定各抑菌菌株的回收率，見表2。

從表2的回收率試驗結果可以看出：A組采用0.2mL皿供試液的培養基稀釋法后，對金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的回收率仍低于70%。B組采用0.5mL/皿供試液的培養基稀釋法后，對枯草芽胞桿菌的回收率即達到了70%，說明加入的15g聚山梨酯80 起到了中和抑菌性的作用。

2.4 控制菌檢查方法的驗證

呋柳擦劑為外用溶液劑，按照《中國藥典》2010年版，第二部[6]規定，控制菌應檢查金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

2.4.1 金黃色葡萄球菌 試驗組：（1）常規法：取1∶10的供試液10mL和含菌數約為10～100cfu的金黃色葡萄球菌，加入到100mL營養肉湯培養基中。（2）培養基稀釋法：取1∶10的供試液10mL和金黃色葡萄球菌10～100cfu，加入到200 mL營養肉湯培養基中。

供試品組：除不加金黃色葡萄球菌外，其余操作同試驗組。

陽性對照組：除不加供試液外，其余操作同試驗組。

陰性對照組：用稀釋液代替供試液，其余操作同試驗組。

2.4.2 銅綠假單胞菌 試驗組：（1）常規法：取1∶10的供試液10mL和含菌數約為10～100cfu的銅綠假單胞菌，加入到100mL膽鹽乳糖培養基中。（2）培養基稀釋法：取1∶10的供試液10mL和銅綠假單胞菌10～100cfu，加入到200mL膽鹽乳糖培養基中。

供試品組：除不加銅綠假單胞菌外，其余操作同試驗組。

陽性對照組：除不加供試液外，其余操作同試驗組。

陰性對照組：用稀釋液代替供試液，其余操作同試驗組?？刂凭鷻z查方法的驗證結果，見表3。

表3 控制菌檢查方法的驗證結果

藥品名稱 金黃色葡萄球菌 銅綠假單胞菌

常規法 稀釋法 常規法 稀釋法

A組 - - - +

B組 - + + /

注：表中“+”代表該反應呈陽性，“-”代表該反應呈陰性。

2.5 微生物限度檢查方法的驗證結果

2.5.1 計數方法的驗證結果 通過驗證試驗，采用0.5mL/皿供試液的培養基稀釋法即能有效去除其抑菌作用，使回收率均達到70%以上。

2.5.2 控制菌檢查方法的驗證結果 呋柳擦劑采用培養基稀釋法檢查金黃色葡萄球菌，采用常規法檢查銅綠假單胞菌。

3 討論

呋柳擦劑含水楊酸、苯甲酸、鞣酸和呋喃西林等成分，在10mL供試品中直接加入稀釋劑制成的供試液，對試驗菌有較強的抑菌性。當制備供試液時先將10mL供試品與15g聚山梨酯80混合后，再加入稀釋劑制成的供試液，能有效去除其抑菌作用，方法簡單、快速，節約成本，科學可靠。聚山梨酯80是非離子型表面活性劑，具有乳化、增溶和穩定的作用，一方面增加了藥品的溶解性，另一方面對微生物有保護作用[7-11]，通過試驗證明，聚山梨酯80對試驗菌株無抑菌性，不會對微生物造成損傷[12-16]。在供試品中添加聚山梨酯80可有效地降低其抑菌性，但由于不同的供試品抑菌性不同，抑菌性強需要其濃度高，可在試驗中適當調節。試驗中發現，在制備供試液時應充分搖勻，使供試品在稀釋劑中分散均勻，確保試驗的重復性和可靠性。

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（收稿日期：2015-07-10）