RP—HPLC法測定扁枝槲寄生中齊墩果酸的含量

王曉蓉??孫歡??劉勝蘭??胡剛??秦雪

[摘要] 目的 建立測定扁枝槲寄生中齊墩果酸的RP-HPLC法。 方法 采用反相高效液相色譜法：Sepax Sapphire C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫17℃，流動相為乙腈-甲醇-0.05%醋酸銨（69∶12∶21），流速0.9mL/min，檢測波長：210nm。 結果 齊墩果酸在1.2～2.4μg范圍內與峰面積成良好線性關系（R2=0.9992），回收率為97.6%。 結論 本方法操作簡便，測定結果準確、重現性好，可用于扁枝槲寄生藥材及飲片的質量控制。

[關鍵詞] 扁枝槲寄生；齊墩果酸；RP-HPLC

[中圖分類號] R284 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）17-51-03

RP-HPLC determination of oleanolic acid in viscum articulatum

WANG Xiaorong SUN Huan LIU Shenglan HU Gang QIN Xue

Panzhihua Institute for Food and Drug Control， Panzhihua， Sichuan， Panzhihua 617000， China

[Abstract] Objective To establish a determination method of oleanolic acid in Viscum articulatum by RP-HPLC. Methods The determination was carried out by RP-HPLC： The analytical column was Sepax Sapphire C18 （250mm×4.6mm， 5μm） and the column temperature was 17℃， it applied with acetonitrile-methyl alcohol-0.05% ammonium acetate （69∶12∶21） as the mobile phase， the flow rate was 0.9 mL/min， the UV detection wave length was 210nm. Results Oleanolic acid showed a good linearity in range of 1.2-2.4μg （R2=0.9992）， the average recovery was 97.6%. Conclusion The method is simple， the result is accurate and has a good reproducibility， it can be used to quality control of viscum articulatum.

[Key words] Viscum articulatum； Oleanolic acid； RP-HPLC

桑寄生科槲寄生屬植物扁枝槲寄生Viscum articulatum Burm.f.，收載于《四川省中藥材標準》[1]，其味苦，平，常用于祛風濕、補肝腎、強筋骨、安胎，與收載于《中國藥典》的同屬植物槲寄生具有同等功效[2]。目前關于它的化學成分研究較少，已見報道的有：黃酮類、三萜類及醇胺類等化合物[3-6]。有文獻通過探究中藥材中齊墩果酸與熊果酸的質控指標發現，很多以前認為僅含齊墩果酸或熊果酸一種成分的藥材，經再研究證實實為同時含有齊墩果酸和熊果酸兩種成分[7-8]，鑒于扁枝槲寄生的現行質量標準是采用薄層掃描法測定齊墩果酸的含量來評價，而至今尚無文獻對其是否還含有熊果酸進行研究報道，且筆者按其質量標準進行薄層鑒別，發現此實驗條件下無法分離齊墩果酸與熊果酸這一對性質相近的同分異構體，不能驗證用薄層掃描法的斑點究竟是齊墩果酸的的單一組分還是與熊果酸的混合物，這直接影響了測定結果的準確性與可信度。故本實驗旨在通過建立RP-HPLC法對扁枝槲寄生中齊墩果酸含量的測定，以期更準確、全面、客觀的評價扁枝槲寄生的質量。現報道如下。

1 實驗材料

1.1 儀器

waters 2695-2489高效液相色譜儀；XS205型電子天平。

1.2 試藥、試劑

扁枝槲寄生：購自四川御鼎堂中藥飲片有限公司。

對照品：齊墩果酸對照品（中國食品生物制品鑒定所，批號：110709-200505）、熊果酸對照品（中國食品生物制品鑒定所，批號：110742-200314）。

試劑：甲醇、乙腈為色譜純，其他均為分析純；水為雙蒸水。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：sapphire C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-甲醇-0.05%醋酸銨（69∶12∶21）；流速：0.9mL/min；柱溫：17℃；檢測波長：210nm；進樣量：10μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別取齊墩果酸、熊果酸對照品適量，精密稱定，置同一容量瓶中，加甲醇制成分別含0.15mg/mL

表1 加樣回收試驗結果

樣品號 稱樣量（g） 齊墩果酸 熊果酸

加標量（mg） 回收率（%） RSD（%） 加標量（mg） 回收率（%） RSD（%）

1 1.0122 3.0124 97.23 0.73 2.0098 96.03 0.95

3.1118 98.16 2.1011 97.68

2 1.0458 2.9984 97.69 2.0346 97.23

3.0031 98.54 2.0755 96.17

3 0.9987 3.0752 96.39 1.9973 95.38

2.9876 97.07 2.1102 96.29

4 1.0264 3.0227 98.41 2.0458 96.72

3.1088 97.93 2.1215 95.04

5 1.0735 3.0450 97.52 2.0216 97.81

3.0663 96.77 2.0073 96.17

表2 重復性試驗結果

樣品號 稱樣量（g） 齊墩果酸 熊果酸

峰面積值 含量（%） RSD（%） 峰面積值 含量（%） RSD（%）

1 1.0122 1251858 0.601 1.31 / / /

1267175 0.609 / /

2 1.0458 1283653 0.597 / / /

1279874 0.595 / /

3 0.9987 1243668 0.605 / / /

1259211 0.609 / /

4 1.0264 1253893 0.594 / / /

1270770 0.602 / /

5 1.0735 1293756 0.586 / / /

1301183 0.589 / /

齊墩果酸、0.1mg/mL熊果酸的混合溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取扁枝槲寄生藥材，粉碎過四號篩，再取藥材粉約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25mL甲醇，密塞，稱定重量，超聲處理30min，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45μm濾膜，即得。

2.4 測定方法及含量計算

分別精密吸取混合對照品溶液及供試品溶液10μL，按上述色譜條件進樣，按峰面積一點歸依法計算含量。

3 實驗方法的驗證與結果

3.1 線性關系試驗

分別精密吸取混合對照品溶液8、10、12、14、16?L，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積積分為縱坐標Y，含量為橫坐標X，繪制標準曲線，得其線性回歸方程與相關系數。齊墩果酸進樣量在1.2～2.4μg的范圍內線性關系良好（R2=0.9992），回歸方程為：Y=542232X-17784；熊果酸進樣量在0.8～1.6μg的范圍內線性關系良好（R2=0.9995），回歸方程為：Y=481249X-24189。

3.2 精密度試驗

精密吸取上述混合對照品溶液10μL，按上述色譜條件，重復進樣5次，測得齊墩果酸、熊果酸的峰面積值間的RSD分別為1.03%、1.27%，均≤3%。可見實驗數據精密度良好，結果可靠。

3.3 穩定性試驗

精密吸取上述混合對照品溶液10μL，于上述色譜條件下，分別在0、4、8、12、24h后進樣，測得齊墩果酸、熊果酸的峰面積值間的RSD分別為1.39%、1.58%，均≤3%。可見混合對照品溶液在配制后24h內基本穩定，所得實驗數據可靠。

3.4 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的扁枝槲寄生粉末1g，分別加入齊墩果酸、熊果酸對照品適量，按2.3項下供試品溶液的制備方法平行制備5份。測定峰面積，外標一點法計算含量，得出樣品回收率及相對標準偏差（RSD），結果見表1。由表1可知，該實驗方法回收率較高，達到實驗要求，方法可靠。

3.5 重復性試驗

按2.3項下方法平行制備供試品溶液5份，按上述色譜條件分別進樣10μL，測定峰面積并計算含量與相對標準偏差（RSD），結果見表2。由表2可知：實驗方法重現性良好，采用此方法考察扁枝槲寄生中齊墩果酸的含量可靠。

3.6 方法討論

齊墩果酸與熊果酸同為五環三萜類化合物，僅E環上一個甲基的位置不同，性質極為相近，在中性流動相中均可解離，但很難分離，且柱溫越高分離效果越差，筆者查閱文獻[2，9-12]并經多次試驗，最終選擇乙腈-甲醇-0.05%醋酸銨（69∶12∶21）為流動相，柱溫17℃。藥材中齊墩果酸或熊果酸的提取方法常采用低極性溶劑直接提取或酸水解后再提取[7]，本實驗用甲醇作為低極性溶劑考察了這兩種方法，結果發現甲醇超聲直接提取后雖然雜質峰較多但不干擾實驗，且提取更充分，故樣品的處理采用了甲醇直接超聲提取；在檢測波長的選擇上，通過分別對齊墩果酸和熊果酸對照溶液于200～400nm波段進行波普掃描，最終實驗選取210nm作為特征波長，這也與文獻中大多采用205～220nm波段相一致[9-11]；在上述實驗條件下，齊墩果酸與熊果酸能被檢測出較強的吸收峰且峰型較好，分離度較高（R≥1.5），滿足實驗要求，見圖1。

A

B

A：混合對照品；B：供試品

圖1 RP-HPLC色譜圖

4 小結

本實驗建立的RP-HPLC法測定扁枝槲寄生中齊墩果酸含量的方法，采用齊墩果酸與熊果酸作雙對照品，使測定結果更為準確可靠，由表2和圖1可知：扁枝槲寄生中未檢出熊果酸，這可能與該成分的含量太低或樣品處理有關。按照《四川省中藥材》[1]中扁枝槲寄生的質量標準，本研究對同一批扁枝槲寄生藥材進行齊墩果酸的薄層掃描含量測定，測得結果為0.417%，與本實驗所得結果有所差距，分析原因，這可能與薄層掃描法中為了排除雜質斑點的干擾而進行的諸如萃取、過柱洗脫等復雜的純化手段使待測物質流失有關，且還受薄層板、顯色等諸多因素的影響。本實驗方法不僅靈敏度、重現性與準確度大大高于薄層掃描法，且樣品處理過程簡單，提取更充分，為扁枝槲寄生的質量控制提供了更可靠有效的方法保證與科學依據。

[參考文獻]

[1]四川省衛生廳. 《四川省中藥材標準》2010年版[S].

[2]國家藥典委員會. 《中國藥典》2010年版.（一部）[S].

[3] 王曉林，李美蓉，李良瓊. 扁枝槲寄生化學成分的研究Ⅰ[J]. 華西藥學雜志， 1990， 5（2）：63-68.

[4] 王曉林，李良瓊，李美蓉. 扁枝槲寄生化學成分的研究Ⅱ[J]. 華西藥學雜志， 1992， 7（2）：71-76.

[5] 王曉林，李良瓊，李美蓉. 扁枝槲寄生化學成分的研究Ⅲ[J]. 華西藥學雜志， 1995， 10（1）：1-3.

[6] YL Len， TL Hwang， YM Chung， et al. The inhibition superoxide anion generation in human neutrophils by viscum coloratum[J]. Chemical &Pharmaceutical Bulletin， 2006，54（7）：1063-1066.

[7] 嚴華，蘇健. 藥材中齊墩果酸與熊果酸質控標準的探究[J]. 藥物分析雜志，2009，29（8）：1400-1406.

[8] 嚴華，王寶琹. 對《中國藥典》中收載齊墩果酸、熊果酸藥品質量標準的商榷[J]. 中國藥品標準，2009，10（2）：83-85.

[9] 呂美紅，謝曉梅，查孝柱，等. 反相高效液相色譜法測定木瓜藥材及飲片齊墩果酸和熊果酸含量[J]. 安徽中醫學院學報， 2010， 29（3）：72-74.

[10] 張艷秋，洪金波，劉文林. HPLC法測定裸花紫珠中齊墩果酸與熊果酸的含量[J]. 海南醫學院學報，2009，15 （1）：5-7.

[11] ZH Qi，SW Wang. Determination of oleanolic acid and ursolic acid in the fruits of ligustrum lucidum Alt. of Shanxi by HPLC[J]. Chinese Journal of Information on TCM，2007，14（5）：40-41.

[12] 李全斌，何開勇. 齊墩果酸含量測定的研究進展[J]. 中國執業藥師·質量控制，2011，8（7）：32-34.

（收稿日期：2015-04-07）