染色姜黃中金胺O的檢測方法研究

翟清??楊志偉??石鑫磊??范純玲

[摘要] 目的 建立姜黃用工業(yè)染料金胺O非法染色的檢查方法。 方法 采用TLC法、HPLC-PAD法、HPLC-MS法，對多批次姜黃樣品進(jìn)行定性定量分析。 結(jié)果 經(jīng)檢測30批市售樣品中，有18批檢出金胺，其質(zhì)量濃度在0.12～0.86mg/g。 結(jié)論 姜黃染色所用化工原料為金胺O，本研究所建立的檢測方法，可以滿足定性定量的要求。

[關(guān)鍵詞] 姜黃；金胺O；TLC；HPLC-MS法

[中圖分類號] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）17-57-04

Detection method of staining in turmeric auramine O

ZHAI Qing YANG Zhiwei SHI Xinlei FAN Chunling

Songyuan Institute for Food and Drug Control of Jilin Province， Songyuan 138000， China

[Abstract] Objective Establishment of turmeric with industrial dye staining auramine O illegal screening method. Methods The technique of TLC， HPLC-PAD and HPLC-MS were developed for qualitation and quantitative analysis mutiple batches of samples turmeric. Results After testing 30 batches of commercial samples， six batches detected in auramine， its content in the 0.12～0.86mg/g. Conclusion Turmeric staining with chemical raw materials for auramine O， detection method established in this paper， to meet with qualitative and quantitative requirements.

[Key words] Turmeric； Auramine O； TLC； HPLC-MS

姜黃收載于《中國藥典》2010年版一部，為姜科植物姜黃Curcuma longa L.的干燥根莖。具有破血行氣，通經(jīng)止痛的功效，用于胸脅刺痛，胸痹心痛，痛經(jīng)經(jīng)閉，癥瘕，風(fēng)濕肩臂疼痛，跌撲腫痛[1]。為中醫(yī)臨床較常用中藥，也是多種中成藥的原料藥。由于中藥材市場經(jīng)營還比較混亂，摻雜使假現(xiàn)象比較嚴(yán)重，經(jīng)過市場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，姜黃除用片姜黃冒充外[2-3]，有一部分可能由于保存時間過長或保存溫度過高，出現(xiàn)表面顏色變淺現(xiàn)象，個別中藥經(jīng)營人員為了追求經(jīng)濟(jì)利益，用化工原料金胺O進(jìn)行非法染色。姜黃具有抗癌作用[4]，金胺O對人體有較大的危害，具有致癌作用[5]，不應(yīng)出現(xiàn)在中藥中[6]。近年來，中藥材、中藥飲片常用報道非法使用金胺O染色[7-13]。本研究通過TLC法，HPLC-PAD法、HPLC-MS法，鑒定證明姜黃所用染料為金胺O，并建立了檢查方法，實驗結(jié)果如下。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Waters2695-2988，PAD檢測器，Empower 2色譜工作站。Agilent1200-6410B液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，ChemStation色譜工作站。

1.2 試藥

金胺O對照試劑購自中國食品藥品檢定研究院，批號111770-201011，姜黃對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院，批號121188-200502。姜黃藥材、飲片購自吉林省各地區(qū)的市售樣品。薄層色譜板為硅膠G薄層色譜板，購自青島海洋化工廠分廠；水為超純水，經(jīng)檢驗合格，乙腈為色譜純，其余乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、氨水、磷酸二氫鉀、磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

取本品粉末3g，加25mL 70%乙醇，密封，超聲處理30min，過濾，濾液作為供試品溶液。另取金胺O對照試劑10mg，置100mL量瓶中，加70%乙醇適量使溶解，再加70%乙醇至刻度，搖勻，即得。再取姜黃對照藥材3g，加25mL 70%乙醇，密封，超聲處理30min，過濾，濾液作為供試品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B）試驗，取供試品溶液和對照藥材溶液各10μL、對照試劑溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（4：5：1：1）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，立即檢視。供試品色譜中，在與對照試劑色譜相應(yīng)的位置上，若顯相同顏色的斑點，說明樣品中含有金胺O染色。若不顯示相同顏色的斑點，說明樣品中不含金胺O染色。對照藥材色譜中，在與對照試劑色譜相應(yīng)的位置上，不顯相同顏色的斑點。

1 2 3

1.姜黃對照藥材溶液；2.對照試劑溶液；3.含金胺O姜黃樣品溶液

圖1 姜黃樣品TLC圖

2.2 金胺O的HPLC-PAD法確認(rèn)

2.2.1 色譜條件 色譜柱為phenomenex Luna C18（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈-0.05mol/L醋酸銨（35：65）為流動相；采用二極管陣列檢測器，檢測波長為432nm。理論塔板數(shù)按金胺O對照試劑色譜中的主峰計算，應(yīng)不低于3000。

2.2.2 對照試劑溶液的制備 對照試劑溶液的制備取金胺O對照試劑10mg，置200mL量瓶中，加70%乙醇適量使溶解，再加70%乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取上述薄層鑒別項下的供試品溶液，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取姜黃對照藥材3g，加70%乙醇25mL，密塞，超聲處理30min，濾過，即得。

2.2.5 測定法 吸取供試品溶液與對照試劑溶液及陰性對照溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.2.6 專屬性試驗 為了證明該方法具有專屬性，將對照試劑溶液，含金胺O樣品、陰性樣品（對照藥材）溶液，分別進(jìn)樣，進(jìn)行液相色譜的考察，結(jié)果薄層色譜含有金胺O的樣品溶液呈現(xiàn)與金胺O對照試劑保留時間相同的色譜峰；比較320～450nm波長范圍的紫外一可見吸收光譜，吸收光譜相同。陰性樣品（對照藥材）溶液未檢出與金胺O對照試劑相同的色譜峰。從而證明該補(bǔ)充檢驗方法和檢驗項目具有專屬性。見圖2～3。

1

2

3

1.對照試劑溶液；2.含金胺0供試品溶液；3.陰性（對照藥材）溶液

圖2 金胺O對照試劑、含金胺O樣品、陰性液相色譜圖

1

2

3

1.對照試劑溶液；2.含金胺0供試品溶液；3.陰性（對照藥材）溶液

圖3 金胺O對照試劑、含金胺O樣品、陰性紫外-可見吸收光譜圖

2.3 金胺O的HPLC-MS法進(jìn)一步確認(rèn)

2.3.1 色譜條件 色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的Phenomenex Gemini C18色譜柱，以乙腈-0.05mol/L醋酸銨（35：65）為流動相，流速為0.6mL/min，檢測波長為432nm。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）正離子檢測，二級質(zhì)譜全掃描模式，母離子m/z268.1，子離子掃描范圍m/z20～300，；干燥氣溫度350℃，干燥氣流速10L/min；源電壓4kV；裂解電壓170V；霧化氣壓力241kPa；碰撞能量30eV。

2.3.3 測定法 取上述HPLC-PAD法測定用的對照試劑溶液及含有金胺O的樣品溶液10μL，注入Agilent1200-6410B液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)測定，進(jìn)行二級質(zhì)譜全掃描（MS/MS）分析。

2.3.4 結(jié)果 兩者出現(xiàn)相同的選擇離子流色譜峰，因此證實姜黃染色物為金胺O。二級質(zhì)譜圖見圖4。

2.4 HPLC檢查方法的建立與驗證

2.4.1 線性范圍考察 精密稱取金胺O對照試劑適量，加70%乙醇制成5.12、10.23、20.46、40.92、81.84μg/mL的溶液，分別精密吸取10μL進(jìn)樣測定，以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，計算回歸方程Y=7063532.8024X+1203.2070（r=1.0000），結(jié)果表明金胺O在0.0512～0.8184μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

A金胺O對照試劑溶液；B含金胺0供試品溶液

圖4 金胺O對照試劑、含金胺O樣品二級質(zhì)譜圖

2.4.2 精密度試驗 取一份供試品溶液，在色譜條件下不變的情況下，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，測定色譜峰面積，計算RSD=0.1%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取一份供試品溶液，在色譜條件不變的情況下，每隔4h進(jìn)樣1次，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10μL，測定色譜峰面積，RSD=0.1%，結(jié)果表明24h內(nèi)供試品溶液中金胺O基本穩(wěn)定。

2.4.4 重現(xiàn)性試驗 取同一供試品6份，分別按供試品溶液制備的方法制成供試品溶液，取對照試劑溶液及上述供試品溶液分別進(jìn)樣，結(jié)果6份樣品均檢出金胺O。確定所采用的檢查方法具有重現(xiàn)性。

2.4.5 耐用性 通過用同一供試品溶液的3支色譜柱進(jìn)樣，證明了采用的方法在實驗條件有所改變時，該方法仍然適用。

2.4.6 回收率 精密稱取已知質(zhì)量濃度的供試品粉末（金胺O質(zhì)量濃度為0.7mg/g）6份，每份約1g，分別精密加入金胺O對照試劑溶液（0.1021mg/mL）7.0mL，依法測定，計算回收率。測得金胺O的平均回收率為98.97%，RSD=0.5%。結(jié)果見表1。

2.4.7 樣品測定 取市售姜黃樣品30批，按上述方法測定金胺O質(zhì)量濃度，結(jié)果有18批含有金胺O，質(zhì)量濃度在0.12～0.86mg/g。結(jié)果見表2。

3 討論

金胺O，又稱鹽基淡黃、金絲雀黃、奧黃、堿性槐黃等，為化工色素，被國際癌癥研究所（IARC）列為人類致癌化合物。主要用于醋纖、棉織品的染色，和紙張、皮革、油漆等的著色。人接觸可引起中毒，對皮膚黏膜有輕度刺激，可引起結(jié)膜炎、皮炎和上呼吸道刺激癥狀，長期食用，體內(nèi)殘留物將對人體腎臟、肝臟造成損害，甚至致癌，因此不應(yīng)用于中藥染色。

姜黃主要含揮發(fā)油、姜黃素等成分，按照《中國藥典》一部要求應(yīng)該置陰涼干燥處儲存，但銷售使用單位一般均未按要求儲存，加上姜黃使用量不多，經(jīng)過長時間儲存可能使揮發(fā)油揮發(fā)，致使有效成分質(zhì)量濃度不夠。姜黃素也叫姜黃色素，本身實際上也常用于染色，但長時間暴露在空氣中，有效成分質(zhì)量濃度會有所降低，也出現(xiàn)顏色變淺現(xiàn)象，一些藥商為了追求經(jīng)濟(jì)利益，對其進(jìn)行金胺O染色，而且不論姜黃藥材還是姜黃飲片，均有染色現(xiàn)象。在制備供試品溶液時，對甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇分別進(jìn)行了考察，結(jié)果根

表1 金胺O回收率試驗結(jié)果

NO 取樣量（g） 樣品質(zhì)量濃度（mg） 加標(biāo)量（mg） 測得量（mg） 回收率（%）

1

2

3

4

5

6 1.0184

1.0101

0.9788

1.0406

1.0148

1.0026 0.7129

0.7071

0.6852

0.7284

0.7104

0.7018 0.7147

0.7147

0.7147

0.7147

0.7147

0.7147 1.4167

1.4159

1.3899

1.4362

1.4228

1.4083 98.47

99.17

98.60

99.03

99.68

98.85

表2 54批市售樣品測定結(jié)果

序號 品名 樣品來源 規(guī)格 TLC結(jié)果 HPLC-PAD結(jié)果 HPLC-MS結(jié)果 金胺O質(zhì)量濃度（mg/g）

1 姜黃 安徽亳州 飲片 檢出 檢出 檢出 0.14

2 姜黃 山東濟(jì)南 藥材 未檢出 未檢出 未檢出 /

3 姜黃 河北安國 飲片 檢出 檢出 檢出 0.12

4 姜黃 河北安國 飲片 未檢出 未檢出 未檢出 /

5 姜黃 四川 飲片 檢出 檢出 檢出 0.29

6 姜黃 河北安國 飲片 檢出 檢出 檢出 0.22

7 姜黃 安徽亳州 飲片 未檢出 未檢出 未檢出 /

8 姜黃 山東濟(jì)南 飲片 檢出 檢出 檢出 0.61

9 姜黃 安徽亳州 飲片 未檢出 未檢出 未檢出 /

10 姜黃 安徽亳州 飲片 檢出 檢出 檢出 0.86

11 姜黃 安徽亳州 飲片 檢出 檢出 檢出 0.80

12 姜黃 河北安國 飲片 未檢出 未檢出 未檢出 /

13 姜黃 安徽亳州 飲片 未檢出 未檢出 未檢出 /

14 姜黃 安徽亳州 飲片 檢出 檢出 檢出 0.49

15 姜黃 河北安國 藥材 檢出 檢出 檢出 0.55

16 姜黃 安徽亳州 飲片 未檢出 未檢出 未檢出 /

17 姜黃 安徽亳州 飲片 檢出 檢出 檢出 0.39

18 姜黃 安徽亳州 飲片 未檢出 未檢出 未檢出 /

19 姜黃 安徽亳州 飲片 檢出 檢出 檢出 0.73

20 姜黃 河北安國 飲片 未檢出 未檢出 未檢出 /

21 姜黃 安徽亳州 藥材 檢出 檢出 檢出 0.44

22 姜黃 安徽亳州 飲片 未檢出 未檢出 未檢出 /

23 姜黃 河北安國 藥材 檢出 檢出 檢出 0.37

24 姜黃 安徽亳州 藥材 檢出 檢出 檢出 0.34

25 姜黃 河北石家莊 飲片 檢出 檢出 檢出 0.31

26 姜黃 山東濟(jì)南 藥材 未檢出 未檢出 未檢出 /

27 姜黃 河北安國 飲片 檢出 檢出 檢出 0.49

28 姜黃 河北安國 飲片 檢出 檢出 檢出 0.63

29 姜黃 河北安國 飲片 未檢出 未檢出 未檢出 /

30 姜黃 安徽亳州 飲片 檢出 檢出 檢出 0.38

據(jù)薄層色譜法所顯斑點顏色深淺和液相色譜峰的大小，判斷用70%乙醇提取，提取率最高；提取方法采用加熱回流和超聲處理兩種方法進(jìn)行考察，結(jié)果超聲處理優(yōu)于回流提取。

從表2可以看出，30批樣品中有18批檢出金胺O，TLC法和HPLC法測定結(jié)果一致，并且HPLC-MS法具有高度的專屬性，沒有誤判現(xiàn)象出現(xiàn)。

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（收稿日期：2015-04-18）