乳腺癌原發灶間質纖維化與免疫微環境及預后的關系

趙立朝，蔡宏劍，莊興俊，李露佳

在乳腺癌的發生發展和轉移過程中，腫瘤細胞與腫瘤微環境內的成纖維細胞、細胞外基質纖維結構和免疫細胞的相互作用至關重要，也成了近年來研究的熱點［1］。腫瘤的細胞外基質纖維結構與正常組織相比明顯增多，其成分以膠原蛋白為主，此外還包括纖維連接蛋白、蛋白聚糖、層粘連蛋白等［2］。腫瘤基質纖維結構能夠抑制T細胞向腫瘤間質及癌巢的浸潤［3］，并且抑制治療藥物向腫瘤內滲透［2］。 本研究中，筆者通過乳腺癌原發灶的HE切片觀察腫瘤間質纖維化程度，用免疫組織化學的方法檢測淋巴細胞亞群（CD4＋T細胞、CD8＋T細胞、CD20＋B細胞）的浸潤強度。分析間質纖維化程度與淋巴細胞浸潤的關系，并分析間質纖維化程度與早期乳腺癌術后無病生存（disease free survival，DFS）和總生存（overall survival，OS）的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象納入標準 2001年1月—2003年12月在解放軍總醫院手術的具有完整臨床及隨訪資料以及病理標本的Ⅰ～Ⅲ期女性乳腺癌患者。術前檢查未發現遠處轉移，病理證實為乳腺原發腫瘤，醫院病理科保存有原發腫瘤的石蠟包埋標本，有完整的臨床資料。共136例符合標準。對符合標準的136例患者進行電話隨訪，失訪10例，最終有126例患者被納入。

1.2 免疫組織化學染色方法 調閱126例乳腺癌患者石蠟組織標本，連續切片3張3 μm薄片分別置于陽離子防脫片上。石蠟切片65℃烘烤2 h，二甲苯脫蠟10 min×2次，梯度乙醇水化，蒸餾水漂洗2 min×3次。將組織切片置于檸檬酸緩沖液（pH6.0）或 Tris－EDTA 緩沖液（pH9.0）中進行高壓修復，3%H2O2中避光室溫孵育10 min，山羊血清37℃孵育10 min后滴加一抗工作液，4℃冰箱保濕盒內過夜。所用一抗為：鼠抗人 CD8 單克隆抗體（DAKO，623，稀釋度 1∶100），兔抗人CD4單克隆抗體 （中衫金橋，ZA－0519，稀釋度1∶100），鼠抗人 CD20 單克隆抗體（DAKO，604，稀釋度 1∶200）。次日取出保濕盒，復溫30 min。漂洗后滴加適量兔鼠通用型EnVisionTM二抗工作液（DAKO），37℃孵箱孵育30 min。以上所有步驟前后均用PBS緩沖液漂洗5 min×3次。DAB顯色1～3 min，蘇木素復染胞核 1～2 min，鹽酸酒精分化，溫水返藍約5 min，顯微鏡下觀察染色及分化程度。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片保存。

實驗設陽性對照和陰性對照，陽性片為人扁桃體。陰性對照以一抗稀釋液代替一抗。

1.3 免疫組化結果及HE切片人工判讀方法 組織切片由2位獨立的病理醫師（對臨床和預后情況不知曉）分別進行分析，核對所得結果，獲得共識。淋巴細胞癌巢浸潤判讀：有明確的陽性淋巴細胞浸潤入癌巢的腫瘤細胞之間均判讀為癌巢浸潤陽性，否則為陰性。CD4＋、CD8＋淋巴細胞亞群在腫瘤間質密度的計數方法如下：LEICA DM2000顯微鏡下在切片腫瘤區域隨機取15個高倍視野（400×），鏡下計數間質陽性細胞數，得出平均每個高倍視野的陽性細胞數并除以高倍視野面積0.31 mm2，得出平均每平方厘米陽性細胞數。CD20＋間質細胞判讀方法：根據是否存在聚集分布將患者分為聚集陽性和聚集陰性2組。調閱患者原發灶的HE染色切片，隨機取3個低倍視野（100×），根據細胞外基質纖維結構（HE切片中為均一的粉紅色非細胞結構）的多少分別得出纖維化程度評分：1＋＝纖維化程度低、2＋＝纖維化程度中等、3＋＝纖維化程度高，將3個視野得出評分取平均值得到最終的纖維化程度。

1.4 統計學方法 使用SPSS13.0軟件包對數據進行統計學處理。為連續變量的實驗參數之間以及與連續變量的乳腺癌臨床病理參數的相關性采用Spearman秩和檢驗。連續變量與二分類變量臨床病理參數的相關性采用Mann－Whitney U檢驗，與三分類變量臨床病理參數的相關性采用Kruskal－Wallis H檢驗。分類變量之間的相關性采用Perason Chi－Square檢驗。年齡按照中位數（48歲）分為2組并賦值、Ki－67按照公認臨界值14%分為2組并賦值，所得數據參與單因素和多因素的生存分析。間質纖維化程度（中位數＝2.33）按照中位數分為2組并賦值，所得數據參與生存分析。生存分析選用Kaplan－Meier法，單因素分析顯著性檢驗選用Log－rank檢驗，多因素分析采用COX風險比例模型。P＜0.05為差異有統計學意義，單因素P＜0.1被認為存在相關趨勢。

2 結 果

2.1 乳腺癌患者特征 對符合納入標準的136例患者進行電話隨訪，失訪10例，最終有126例患者被納入，失訪率為8.6%。截至最后隨訪期2013－07－06，中位隨訪時間104個月（7.7～138.6 個月）。患者中位年齡 48 歲（24～80 歲）。所有患者均未接受手術去勢、新輔助放化療和輔助靶向治療。32例局部復發和/或轉移，27例病死；無病生存率74.6%，總生存率79.2%，中位無病生存和中位總生存期尚未達到。126例乳腺癌患者臨床病理因素描述見表1。

2.2 乳腺癌原發灶間質纖維化 乳腺癌間質觀察到不同程度的間質纖維化（圖1）。

2.3 間質纖維化程度與臨床病理因素的相關性分析 間質纖維化程度與 SBR分級負相關 （Kruskal－Wallis H，P＝0.024）。間質纖維化程度與年齡、月經狀況、臨床分期、癌栓、ER、PR、HER－2、Ki67 均不相關。

表1 126例乳腺癌患者的臨床病理特征

2.4 間質纖維化程度與淋巴細胞亞群的相關性分析 間質纖維化程度與CD20＋細胞聚集負相關 （Mann－Whitney U，P＝0.002），與 CD4＋間質細胞密度負相關（Spearman，P＝0.042）；與 CD4＋細胞癌巢浸潤負相關 （Mann－Whitney U，P＝0.038），與 CD20＋細胞癌巢浸潤負相關（Mann－Whitney U，P＝0.002）。與CD8＋細胞癌巢浸潤、CD8＋間質細胞密度不相關。

2.5 間質纖維化程度與預后的關系 總體分析時，單因素分析和多因素分析均未見間質纖維化程度與DFS、OS的關聯性。各臨床病理因素、間質纖維化程度與DFS、OS關系的Cox單因素分析結果見表2。

圖1 乳腺癌原發灶HE染色結果（200×）

表2 各影響因素與乳腺癌患者DFS、DDFS和OS關系的COX單因素分析

3 討 論

腫瘤基質中致密的纖維結構形成了T細胞在腫瘤內移動的物理障礙，能夠抑制T細胞向腫瘤間質及癌巢的浸潤［3］。這一既往研究觀察到的現象在本研究中也得到了部分印證。本研究觀察到，間質纖維化程度較低的腫瘤間質中，CD20＋B細胞聚集的現象更易出現，CD4＋T 細胞浸潤更多［4，5］。致密的間質纖維結構可能阻礙了B細胞之間空間上的聚集靠近。既往研究認為，乳腺癌間質中CD20＋B細胞聚集形成的結構周圍聚集著CD4＋T細胞形成淋巴濾泡樣結構，提示局部存在活躍的免疫反應。間質纖維化程度與CD4＋T細胞及CD20＋B細胞在癌巢中的浸潤負相關，提示，間質纖維化對淋巴細胞向癌巢內移動起到了阻礙作用。

既往研究認為，間質纖維化能夠促進腫瘤侵襲并與化療耐藥有關。腫瘤相關成纖維細胞大量合成I型膠原（collagen I），參與間質重構，形成平行有序的基質結構，從而有利于腫瘤細胞的侵襲移動［6，7］。腫瘤相關成纖維細胞合成的I型膠原與給藥后腫瘤內較低的化療藥物濃度有關［8］。乳腺癌動物模型研究中，用DNA疫苗降低腫瘤相關成纖維細胞合成I型膠原后，給藥后腫瘤內阿霉素等化療藥物的濃度顯著增加；可以將乳腺癌肺轉移小鼠模型的存活時間與單獨化療相比延長了 3 倍［7］。

總之，乳腺癌原發灶較強的間質纖維化限制了B細胞形成聚集，并且限制淋巴細胞細胞對癌巢的浸潤，發揮了抑制免疫的作用。

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