紅花甙對過氧化氫誘導SH－SY5Y細胞凋亡保護作用的實驗研究

凌志揚，孫曉峰

氧自由基損傷與許多中樞神經系統退行性病變的發生發展密切相關。如：帕金森病、阿爾茲海默病、多發性硬化等。尋找防治氧自由基損傷的藥物對于防治神經退行性疾病具有重要意義［1］。紅花甙（carthamin，CAS number：36338－96－2） 是我國傳統名藥紅花（flower of carthamus tinctorius）的主要成分［2］。有廣泛的心腦血管系統活性。近來有實驗證明紅花甙有較強的清除氧自由基的作用［3］。本實驗利用過氧化氫（H2O2）致神經母細胞瘤細胞SH－SY5Y細胞株凋亡為神經細胞氧自由基損傷模型，探討紅花甙是否能對抗神經細胞氧化應激損傷，為紅花甙用于防治神經系統退行性病變提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與細胞 紅花甙購自科星貿易有限公司。SH－SY5Y細胞購于中國科學院上海生化細胞所。DMEM/F12培養基購于美國Hyclone公司。AnnexinⅤ－APC和碘化丙錠 （PI） 染料購于invitrogen公司。細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養液，置 CO2培養箱（37 ℃、5%CO2）培養，換液1次/2 d，待細胞鋪滿培養皿底部80%時，分組進行實驗。

1.2 分組及藥物處理 實驗分為空白組 （B）、損傷組（I）及紅花甙低（CA－L）、中（CA－M）、高（CAH）劑量組。除空白組外，其余各組均加入終濃度為50 μmol/L的H2O2，受試藥組同時給予紅花甙終濃度分別為 20、40、80 μmol/L 繼續培養 12 h，測定各項實驗指標。

1.3 MTT法檢測細胞活性 細胞消化后配成單細胞懸液，以每孔1×104個細胞接種于96孔培養板，每組細胞8復孔，于培養結束前4 h加入5 g/L MTT 20 μl，培養結束后，傾去培養基，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩混勻，使結晶完全溶解，用酶聯免疫檢測儀于570 nm波長處測定其吸光度值A。對照組細胞生長率為100%，其余各組存活率＝A實驗/A對照×100%。

1.4 比色法測細胞培養液中MDA含量 分別取各組細胞上清液100 μl，按MDA測定試劑說明書操作，比色法測定細胞培養液中MDA的OD值并計算其含量。

1.5 流式檢測細胞凋亡率 將各組細胞用胰蛋白酶消化后，用PBS洗滌細胞2次。用去離子水按1∶4稀釋結合緩沖液，加入250 μl結合緩沖液重新懸浮細胞，使其濃度為 1×106/ml；取 100 μl的細胞懸液于 5 ml流式管中，加入 5 μl Annexin Ⅴ－APC 和 5 μl 20 μg/ml的碘化丙錠（PI）溶液；混勻后于室溫避光孵育15 min；在反應管中加入400 μl PBS，流式細胞儀檢測、分析。

2 結 果

2.1 紅花甙對SH－SY5Y細胞活性的影響 損傷組SH－SY5Y細胞存活率29.7%，明顯低于對照組（P＜0.01），說明 H2O2引起 SH－SY5Y 細胞損傷；與損傷組比較，CA－L、CA－M、CA－H 組細胞存活率明顯提高（P＜0.05），且隨著劑量增加細胞存活率提高，提示紅花甙對SH－SY5Y細胞的氧自由基損傷具有保護作用，結果見表1，圖1。

表1 各組SH－SY5Y細胞存活率（±s）

表1 各組SH－SY5Y細胞存活率（±s）

注：與空白組相比，△P＜0.01；與損傷組相比，＊P＜0.05，＃P＜0.01

組別 n B組 6 I組 6 CA－L 組 6 CA－M 組 6 CA－H 組 6劑量（μmol/L） 吸光度A值 細胞存活率（%）0 0.821±0.067 100±5.32 0 0.243±0.034△ 29.7±2.92△20 0.306±0.027＊ 37.31±2.07＊40 0.451±0.052＃ 54.93±4.01＃80 0.583±0.048＃ 70.06±3.92＃

圖1 紅花甙對H2O2損傷SH－SY5Y細胞存活率的影響

2.2 細胞培養液中MDA含量測定結果 由表2可見，與空白組相比，損傷組培養液中MDA含量明顯增加 （P＜0.01）。 與損傷組相比， 紅花甙能降低MDA的生成，并隨著紅花甙加入量的增加而逐漸降低。

2.3 流式檢測細胞凋亡率 在流式細胞術參數散點圖上，左下象限顯示活細胞；右下象限為早期凋亡細胞；右上象限為晚期凋亡細胞和壞死細胞；左上象限是壞死細胞。以右下象限細胞的百分數為考察指標，結果顯示損傷組細胞比空白組凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與損傷組比較，紅花甙高、中、低劑量組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），且隨著紅花甙劑量增加凋亡率逐漸降低。見圖2、表3。

表2 各組SH－SY5Y細胞MDA生成情況（±s）

表2 各組SH－SY5Y細胞MDA生成情況（±s）

注：與空白組相比，△P＜0.01；與損傷組相比，＊P＜0.05，＃P＜0.01

組別 n B組 6 I組 6 CA－L 組 6 CA－M 組 6 CA－H 組 6劑量（μmol/L） MDA（nmol/ml）0.2127±0.0187 0.8791±0.0332△20 0.6223±0.0221＊40 0.4749±0.0331＃80 0.3225±0.0272＃

圖2 流式細胞術監測細胞凋亡

表3 各組細胞凋亡率（±s，n＝3）

表3 各組細胞凋亡率（±s，n＝3）

注：與空白組相比，△P＜0.01；與損傷組相比，＊P＜0.05，＃P＜0.01

組別 劑量（μmol/L） 凋亡率（%）B 0 1.8±0.2 I 27.6±2.2△CA－L 20 23.2±1.6＊CA－M 40 18.5±0.9＃CA－H 80 7.1±0.5＃0

3 討 論

近年研究表明，氧化應激損傷在神經退行性病變的發病中起著重要作用［4］。神經組織中含有大量不飽和脂肪酸，并且神經組織中抗氧化物質含量低，使其更易受到活性氧的損傷［5］。過氧化氫（H2O2）是一種很好的活性氧供給體，其供給的活性氧參與了許多神經系統疾病的發病，常用作神經細胞氧化損傷的誘導劑［6］。SH－SY5Y細胞是神經母細胞瘤細胞株，具備了神經細胞的一般生物學特征，能穩定傳代，可以作為神經細胞的體外模型。H2O2誘導SH－SY5Y細胞凋亡可以作為神經細胞氧化應激模型［7］。

本文實驗以體外培養SH－SY5Y細胞為對象，考察了紅花甙對SH－SY5Y細胞凋亡的保護作用。結果顯示：H2O2處理SH－SY5Y細胞后，流式細胞儀可檢測到細胞凋亡，說明一定量的H2O2能使SHSY5Y細胞發生凋亡。紅花甙使H2O2作用下的SHSY5Y細胞生存率提高，脂質氧化產物丙二醛減少，并且流式細胞儀檢測發現紅花甙使H2O2導致的細胞凋亡率降低，說明紅花甙對H2O2誘導SH－SY5Y細胞的凋亡具有保護作用。

目前尋找抗神經細胞氧化應激損傷的藥物方興未艾。該類藥物在治療阿爾茲海默病等神經系統退行性病變中有巨大潛力［8］。本研究發現紅花甙能抗氧自由基對神經細胞的損傷，這為紅花甙用于抗中樞神經系統氧化應激損傷提供了依據，但其作用機制尚需進一步深入研究。

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