氯通道阻斷劑DIDS對過氧化氫誘導PC12細胞凋亡的影響*

任京力，林 玲，王雁梅，王福青，李超彥，蔡智慧，常全忠

1)漯河醫學高等?？茖W校藥學系藥理學教研室 漯河462002 2)漯河醫學高等專科學?；A部生理學教研室 漯河462002 3)遵義醫學院珠海校區生理學教研室 珠海519041

缺血性腦損傷是一種嚴重危害人類健康的疾病，具有較高的發病率、致殘率和病死率。缺血中心區神經元的壞死是不可挽救的死亡形式，而缺血周邊區神經元的凋亡是一種受程序控制的主動死亡形式，闡明凋亡機制并尋找有效的靶點拮抗藥物顯得十分重要。氯離子的活動可能參與了缺血性腦損傷神經元凋亡的過程，4，4'-二異硫氰基芪-2，2'-二磺酸(4，4'-diisothiocyanostibibene-2，2'-disulfonic acid，DIDS)作為一種氯離子通道阻斷劑可以拮抗離體神經元的凋亡［1-3］。為進一步探討DIDS 的抗凋亡機制，作者利用H2O2誘導大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株PC12 細胞凋亡，觀察DIDS 對細胞凋亡的影響，報道如下。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器 DMEM/F12 基礎培養基、H2O2購自Gibco 公司，Bcl-2 抗體、Caspase-3 多克隆抗體購自Sigma 公司。倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯2X71)，二氧化碳培養箱(上海力申科學儀器有限公司)，蛋白電泳及轉膜電泳裝置(北京六一儀器廠)，流式細胞儀(美國BD FACSCALIBUR)。

1．2 實驗分組 高分化PC12 細胞株購于中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。參考文獻［4］，取對數生長期的細胞，隨機分為9組。對照組細胞常規培養12 h;余8組細胞分別用400 nmol/L H2O2與0(模型組)、5、10、50、100、200、300、400 μmol/L DIDS 培養。培養12 h 后，收集各組細胞，測定細胞存活率，選取最佳DIDS 濃度組進行相關指標的檢測。

1．3 MTT 法測定細胞存活率 具體操作參照文獻［5-6］。細胞存活率=(吸光度實驗組－吸光度空白)/(吸光度對照組－吸光度空白)×100%。

1．4 Western blot 法檢測Caspase-3 和Bcl-2 蛋白參照文獻［6-7］。取對照組、模型組和100 μmol/L DIDS組細胞，用冰冷的0．1 mol/L PBS 洗滌2次，加裂解液收集細胞，低溫離心，收取上清液測定蛋白濃度并用上樣緩沖液調整，煮沸10 min 后加樣，SDSPAGE 電泳，PVDF 膜轉移，胎牛血清封閉液封閉，加Caspase-3 多克隆抗體(1∶1 000)和Bcl-2 單克隆抗體(1∶800)，4℃過夜，加HRP 標記的羊抗兔IgG室溫反應2 h 后，ECL 顯影。以β-actin 為內參。Western blot 結果用Quantity One 定量分析軟件進行分析。目的蛋白相對表達量=目的條帶灰度值/βactin 條帶灰度值。

1．5 凋亡率的檢測 參照文獻［8］。取對照組、模型組和100 μmol/L DIDS組細胞，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化，500 r/min 離心，PBS 清洗，離心后收集細胞，用Binding buffer 懸浮細胞，加入Annexin VFITC 混勻后再加入5 μL 碘化丙啶，室溫避光反應15 min，上流式細胞儀檢測。激發波長488 nm，發射波長530 nm。

1．6 統計學處理 采用SPSS 16．0 進行統計學分析，組間細胞存活率、凋亡率、Caspase-3 和Bcl-2 蛋白相對表達量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 各組細胞存活率的比較 見表1。結果顯示，400 nmol/L H2O2可以明顯誘導PC12 細胞損傷，細胞存活率僅35．07%;DIDS 對H2O2誘導的PC12 細胞損傷具有拮抗作用，且具有一定的濃度依賴性。

表1 各組細胞存活率的比較

2．2 對照組、模型組和100 μmol/L DIDS組細胞Caspase-3 和Bcl-2 蛋白表達的比較 見圖1、表2。結果顯示，模型組Caspase-3 蛋白表達較對照組明顯增強，Bcl-2 蛋白表達較對照組明顯減弱;而與模型組比較，100 μmol/L DIDS組Caspase-3 表達減弱，Bcl-2 蛋白表達明顯增強。

圖1 3組細胞Caspase-3、Bcl-2 蛋白的Western blot 檢測

2．3 對照組、模型組和100 μmol/L DIDS組細胞凋亡率的比較 見表2。結果顯示，與對照組比較，模型組和100 μmol/L DIDS組細胞凋亡率均增加，但100 μmol/L DIDS組細胞凋亡率較模型組明顯降低。

表2 3組細胞Caspase-3、Bcl-2 蛋白表達及凋亡率的比較

3 討論

PC12 細胞株是大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株，具有神經細胞的一般特征，因其具有可傳代的特點，故廣泛應用于神經生理和神經藥理學研究［9］。該實驗選用的是高分化PC12 細胞株。H2O2是一種常用的誘導細胞凋亡的化學試劑，該實驗參考文獻［4］并結合預實驗結果，選用400 nmol/L H2O2誘導細胞凋亡。

DIDS 是一種芪衍生物，是一種陰離子通道阻斷劑，對氯離子通道具有非特異性的阻斷作用［10］。有資料［11］顯示，DIDS 對NO 誘導的離體大鼠海馬神經元凋亡具有一定的保護作用，但機制尚不清楚。該實驗結果顯示，DIDS 對H2O2誘導的PC12 細胞凋亡具有濃度依賴性拮抗作用。Caspase-3 和Bcl-2 是與細胞凋亡有直接關系的凋亡蛋白分子。活性Caspase-3 蛋白具有促進細胞凋亡的作用，正常情況下在細胞內很少被激活。Bcl-2 蛋白是一種抗凋亡蛋白［12-13］。該實驗結果顯示，DIDS組細胞Caspase-3 表達較模型組明顯降低，Bcl-2 蛋白表達升高，提示DIDS 具有拮抗H2O2誘導的PC12 細胞凋亡的作用。據此作者推測，DIDS 可能通過Caspase-3 依賴性信號通路發揮抗凋亡作用。氯通道可能參與了H2O2誘導的PC12 細胞的凋亡［3］。氯通道蛋白與凋亡信號通路之間的聯系有待于進一步研究。

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［11］Chang QZ，Zhang SL，Yin JB．Role of chloride channels in nitric oxide-induced rat hippocampal neuronal apoptosis in vitro［J］．Neural Regen Res，2010，5(9):690

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［13］Zhang F，Li F，Chen G．Neuroprotective effect of apigenin in rats after contusive spinal cord injury［J］．Neurol Sci，2014，35(4):583