沉默JP2基因對小鼠心肌細胞SK2通道的影響*

郭文靜，樊紅琨，鄭春光，張桂紅，段 萍，楊 陽，羅天霞，章 茜#

1)鄭州大學基礎醫學院生理學教研室 鄭州450001 2)河南護理職業學院生理學教研室 安陽455001

Junctophilins(JPs)是偶聯細胞膜與細胞內質網離子通道交通的分子基礎，并具有膜偶聯復合物(junctional membrane complexes，JMCs)特性的一類蛋白［1-2］。已知JPs 存在4種亞型，分別為JP1、JP2、JP3 和JP4。JP2 主要存在于骨骼肌和心肌，敲除JP2 可導致興奮-收縮失偶聯，進而引起心肌和骨骼肌收縮障礙［3-4］。SK 通道是依賴于細胞內Ca2+激活的K+通道，其中SK2 通道存在于心肌細胞膜，包括T 管膜［5］。研究［6］表明SK2 通道參與動作電位復極化過程，與室上性心律失常發生的分子機制相關。作者之前的研究［7］表明細胞內Ca2+穩態可影響SK2 通道的功能。該實驗采用RNA 干擾(RNAi)技術研究沉默JP2 基因，觀察對新生小鼠心肌細胞(neonatal mouse cardiomyocytes，NMCMs)SK2 通道的影響。

1 材料與方法

1．1 靶向小鼠JP2 的siRNA 慢病毒質粒的構建根據siRNA 的設計原則及文獻［8］報道，針對Gen-Bank 中小鼠JP2 基因(NM_001205076．1)的2個不同 位 點(5'-GCCACAATGTGCTGGTCAA-3'，5'-GT GATCTTGCTGAA-3')，分別設計2 對靶向JP2 基因并帶Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點的DNA 互補序列和RNAi陰性對照(negative control，NC)序 列(5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3')。經Blast 軟件分析確定序列的特異性。上述序列的合成及重組慢病毒質粒(LV-JP2-RNAi-1、LV-JP2-RNAi-2 和LV-NCEGFP)的包裝和收獲由上海吉凱基因有限公司完成。

1．2 NMCMs 的培養 取出生1～2 d 的昆明小鼠心臟剪碎，37℃低速離心，用含EDTA 的胰蛋白酶(Hyclone 公司)消化，收集細胞懸液，離心，棄上清，用含體積分數20%胎牛血清的DMEM/F12 培養基(美國Gibco 公司)重懸細胞。將細胞懸液接種于35 mm 培養皿，37℃、體積分數5%CO2培養箱孵育90 min。取上清接種于24 孔板，加入5-Brdu 使其終濃度為0．1 mmol/L，37℃、體積分數5%CO2培養箱孵育，36 h 后換液。

1．3 重組慢病毒質粒感染NMCMs 將生長良好、融合至50% 的細胞分為4組，分別轉染LV-JP2-RNAi-1、LV-JP2-RNAi-2 和LV-NC-EGFP，以未轉染細胞(Ctrl-NC)作對照，48 h 后熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達情況。2．5 g/L 胰蛋白酶消化NMCMs。收集各組細胞，流式細胞儀(美國BD公司)檢測感染效率。

1．4 實時熒光定量PCR 檢測JP2 mRNA 的表達收集感染48 h 的細胞，采用Trizol 法抽提總RNA，37℃DNase 處理，合成cDNA 第一條鏈(上海生工生物工程技術服務有限公司)。JP2 基因引物序列:上游5'-CTGGCTATCCTATTTGTTCAC CT-3'，下 游5'-GTTTTAGGTCCGAAGTCCCAT-3'，產物大小135 bp。內參(GADPH)基因引物序列:上游5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，下游5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'，產物大小183 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成。PCR 總反應體系為20 μL。反應條件:95℃2 min;95℃10 s，60℃40 s，40個循環。制備熔解曲線:95℃變性1 min，冷卻至55℃，使得DNA 雙鏈充分結合;從55℃起到95℃，每一步增加0．1℃，保持4 s，同時讀取吸光度值。實驗重復3次。JP2 mRNA 以其與內參基因吸光度比值作為相對表達量。

1．5 Western blot 檢測SK2 通道蛋白的表達 收集感染72 h 細胞，－80℃冰箱儲存備用。提取各組細胞蛋白，100 g/L SDS-PAGE 分離SK2，電泳，轉膜，50 g/L 脫脂牛奶-TBS 室溫封閉1 h，加入兔多克隆抗SK2 抗體(1 ∶300 稀釋，Alamone labs)或β-actin (1∶600 稀釋，美國Sigma 公司)，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000 稀釋)，室溫孵育2 h，ECL 化學發光曝光顯影。

1．6 統計學處理 應用SPSS 17．0 對數據進行分析，采用單因素方差分析和SNK-q 檢驗比較各組間JP2 mRNA 表達的差異，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 重組慢病毒質粒對NMCMs 的感染 NMCMs生長狀態良好，形態正常(圖1A)，倒置熒光顯微鏡下可見明顯的GFP 表達(圖1B)。Ctrl-NC組心肌細胞的轉染效率為0，LV-JP2-RNAi-1 和LVJP2-RNAi-2組心肌細胞轉染效率分別達70% 和80%。

圖1 NMCMs 慢病毒質粒轉染的觀察(×10)

2．2 各組細胞JP2 mRNA 水平 見表1。

表1 各組細胞JP2 mRNA 表達水平

2．3 各組細胞SK2 通道蛋白的表達 與Ctrl-NC及LV-NC-EGFP組細胞比較，LV-JP2-RNAi-2組細胞SK2 通道蛋白的表達明顯被抑制，見圖2。

圖2 各組細胞SK2 通道蛋白的表達

3 討論

在心肌細胞，由T 管膜和肌質網膜形成二聯體膜偶聯復合物，后者是實現心肌興奮-收縮偶聯的重要結構基質［9］。SK2 通道表達于心肌細胞膜，包括T 管膜，細胞內Ca2+濃度的變化是激活SK 通道的惟一因素［10］。JP2 功能異常可影響細胞膜表面離子通道與細胞內Ca2+的偶聯，直接影響心肌或骨骼肌興奮-收縮偶聯過程，導致收縮障礙，如果敲除JP2，動物將于胚胎期死亡［11-12］。

RNAi 是一種序列特異性的、由雙鏈RNA 誘導的基因沉默現象，siRNA 可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數周甚至更久，具有經濟、快捷、高效等顯著優勢，成為RNAi 研究的首選方法［13］。該實驗構建靶向JP2 的siRNA 慢病毒載體，流式細胞儀檢測結果表明它可在心肌細胞內有效表達。該研究將該慢病毒載體轉染至NMCMs，可有效地沉默心肌細胞JP2 mRNA 表達，并可抑制小鼠心肌細胞SK2 通道的表達。

總之，該實驗結果為深入研究JP 與SK 通道在小鼠心肌動作電位中的作用及分子機制奠定了基礎。

［1］Takeshima H，Komazaki S，Nishi M，et al．Junctophilins:a novel family of junctional membrane complex proteins［J］．Mol Cell，2000，6(1):11

［2］Garbino A，Van Oort RJ，Disit SK，et al．Moleculad evolution of the junctophilin gene family［J］．Physiol Genomics，2009，37(3):175

［3］Ito K，Komazaki S，Sasamoto K，et al．Deficiency of triad junction and contraction in mutant skeletal muscle lacking junctophilin type 1［J］．J Cell Biol，2001，154(5):1059

［4］Chopra N，Yang T，Asghari P，et al．Ablation of triadin causes loss of cardiac Ca2+release units，impaired excitationcontraction coupling，and cardiac arrhythmias［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(18):7636

［5］Lu L，Zhang Q，Timofeyev V，et al．Molecular coupling of a Ca2+-activated K++channel to L-type Ca2+channels via alpha-actinin2［J］．Circ Res，2007，100(1):112

［6］Zhang Q，Timofeyev V，Lu L，et al．Functional roles of a Ca2+-activated K++channels in atrioventricular node［J］．Circ Res，2008，102(4):465

［7］Mu YH，Zhao WC，Duan P，et al．RyR2 modulates a Ca2+-activated K++current in mouse cardiac myocytes［J］．PLoS One，2014，9(4):e94905

［8］Lee EH，Cherednichenko G，Pessah IN，et al．Functional coupling between TRPC3 and RyR1 regulates the expressions of key triadic proteins［J］．J Biochem，2006，281(15):10042

［9］Han J，Wu H，Wang Q，et al．Morphogenesis of T-tubules in heart cells:the role of junctophilin-2［J］．Life Sci，2013，56(7):647

［10］Xu YF，Tuteja D，Zhang Z，et al．Molecular identification and functional roles of a Ca2+-activated K++channel in human and mouse hearts［J］．J Biol Chem，2003，278(49):49085

［11］Van Oort RJ，Garbino A，Wang W，et al．Disrupted junctional membrane complexes and hyperactive ryanodine receptors after acute junctophilin knockdown in mice［J］．Circulation，2011，123(9):979

［12］Jayasinghe ID，Baddeley D，Kong CH，et al．Nanoscale organization of junctophilin-2 and ryanodine receptors within peripheral couplings of rat ventricular cardiomyocytes［J］．Biophys J，2012，102(5):L9

［13］Wiedenheft B，Sternberg SH，Doudna JA．RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea［J］．Nature，2012，482(7385):331