HPV16相關宮頸癌組織中MUC16和E6表達的關系*

吳 余，崔 靜，王 虹，付琳琳，李 航，田明振，馮思佳，楊 璐，趙二趁，千新來，原志慶

新鄉醫學院病理學教研室新鄉453003

高危型人乳頭瘤病毒(high risk-human papillomaviruses，HR-HPVs)(如HPV16 等)病毒癌基因E6的持續表達是宮頸癌最重要的致病因素［1］。該課題組設計并篩選了靶向HPV16 E6 且沉默效應均達95%以上的短發夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)，經Agilent 人基因組表達譜芯片分析，發現沉默E6 表達后粘蛋白抗原16(mucin antigen 16，MUC16)基因表達下調。MUC16 是否是HPV16 E6的直接作用靶點及調控機制尚不清楚。因此，深入研究E6 與MUC16 的關系，對探索HPV16 相關腫瘤新的治療方法具有重要意義。該實驗以HPV16 E6陽性和陰性的宮頸癌細胞系和宮頸鱗狀細胞癌(簡稱鱗癌)組織為研究對象，采用Western blot 和免疫組化方法，從細胞和組織水平分析HPV16 E6 和MUC16 表達的關系，以豐富HPV16 E6 的致癌機制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細胞 HPV16 陽性的宮頸癌CaSki 細胞和SiHa 細胞以及HPV16 陰性的宮頸癌C-33A 細胞均購自中國科學院上海細胞庫。培養條件均為含體積分數10%胎牛血清和雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L)的高糖DMEM 培養基，在37℃、體積分數5% CO2孵箱中培養。

1．1．2 組織標本來源 從新鄉醫學院第三附屬醫院和新鄉市第一人民醫院收集宮頸鱗癌組織184例。每例標本常規制備石蠟切片(厚約3 μm)。

1．1．3 主要試劑 胎牛血清為杭州四季青公司產品;DMEM 培養基為美國Millipore 公司產品;二硫蘇糖醇(DTT)、丙烯酰胺、亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)為德國Merk 公司產品;鼠抗人βactin 單克隆抗體、山羊抗HPV16 E6 多克隆抗體、辣根酶標記的兔抗鼠二抗、辣根酶標記的兔抗山羊二抗、辣根酶標記的山羊抗兔二抗和增強化學發光試劑盒均為美國Santa Cruz 公司產品;兔抗人MUC16多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司;DAB 試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司;免疫組化試劑盒為美國Zymed 公司產品。

1．2 Western blot 方法檢測HPV16 E6 及MUC16的表達 常規培養、消化并收集細胞，提取總蛋白。取10 μL 按Bradford 方法進行蛋白定量，對其余蛋白進行變性處理，將1/5 蛋白體積的DTT 和4/5 蛋白體積的2 ×SDS 上樣緩沖液與蛋白樣品混勻后放入沸水中煮5 min，－80℃保存備用。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜后進行Western blot 檢測E6 和MUC16 的表達。以β-actin 為內參，蛋白上樣量均為150 μg，鼠抗人β-actin 單克隆抗體、山羊抗HPV16 E6 多克隆抗體、兔抗人MUC16 多克隆抗體、辣根酶標記的兔抗鼠二抗、辣根酶標記的兔抗山羊二抗和辣根酶標記的山羊抗兔二抗稀釋度分別為1∶1 000、1 ∶300、1 ∶500、1 ∶5 000、1 ∶5 000 和1∶5 000。采用Bandscan 5．0 軟件分析目的條帶與內參條帶的灰度比值。實驗重復3次。

1．3 免疫組化方法檢測HPV16 E6 及MUC16 的表達 采用PV-9000 法。石蠟切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，在枸櫞酸鹽抗原修復液(pH =6．0)中進行微波修復，體積分數3% H2O2溶液室溫孵育20 min、正常山羊血清室溫孵育20 min 后，加稀釋好的一抗工作液(HPV16 E6 為1∶50，MUC16為1∶100)，以PBS 代替一抗作為陰性對照。加通用型IgG 抗體-辣根過氧化物酶多聚體，室溫孵育30 min。顯色，復染，經梯度乙醇、二甲苯處理后，中性樹膠封片，鏡檢。E6 為細胞核染色，MUC16 為細胞質和細胞膜染色。400 倍鏡下選取5個視野(每個視野計數細胞不少于200個)，按陽性細胞所占百分比及著色深淺進行結果判定［2］。①按細胞著色深淺評分:無色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別評為0、1、2、3 分。②按陽性細胞百分比評分:無陽性細胞、陽性細胞百分比＜30%、30%～70%、＞70%分別評為0、1、2、3 分。取2 項評分之和作為總分，0～1 分為陰性，≥2 分為陽性。

1．4 統計學處理 采用SPSS 16．0 進行分析。不同組間MUC16 蛋白相對表達量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。HPV16 E6 陽性和陰性鱗癌組織中MUC16 陽性表達率的比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 Western blot 方法檢測HPV16 陽性和陰性宮頸癌細胞中E6 的表達 Western blot 結果(圖1)顯示:C-33A 細胞中HPV16 E6 無表達，CaSki 細胞和SiHa 細胞中可見HPV16 E6 表達。

圖1 Western blot 方法檢測HPV16 陽性和陰性宮頸癌細胞中E6 的表達

2．2 Western blot 方法檢測HPV16 陽性和陰性宮頸癌細胞中MUC16 的表達 Western blot 結果(圖2、表1)顯示:C-33A 細胞中MUC16 的表達低于Si-Ha 細胞和CaSki 細胞，CaSki 細胞和SiHa 細胞中MUC16 的表達差異無統計學意義。

2．3 宮頸鱗癌組織分組 免疫組化染色結果(圖3)顯示:184例宮頸鱗癌組織中，HPV16 E6 陽性宮頸鱗癌組織138例，HPV16 E6 陰性宮頸鱗癌組織46例。

圖2 Western blot 方法檢測HPV16 陽性和陰性宮頸癌細胞中MUC16 的表達

表1 Western blot 方法檢測HPV16 陽性和陰性宮頸癌細胞中MUC16 的表達(n=3)

圖3 HPV16 E6 陽性(A)和陰性(B)宮頸鱗癌組織染色結果(PV-9000，×200)

2．4 HPV16 E6 陽性和陰性宮頸鱗癌組織中MUC16 的表達 免疫組化染色結果(表2、圖4)顯示:MUC16 陽性染色主要定位于細胞質和細胞膜，呈棕黃色顆粒;HPV16 E6 陽性宮頸鱗癌組織中MUC16 的表達高于HPV16 E6 陰性宮頸鱗癌組織。

表2 MUC16 在HPV16 E6陽性和陰性宮頸鱗癌組織中的表達

圖4 宮頸鱗癌組織中MUC16 陽性(A)和陰性(B)表達(PV-9000，×200)

3 討論

HPVs 感染宿主后，其早期基因E6 整合入宿主細胞基因組DNA 中并恒定表達。E6 蛋白能與宿主細胞內的E6 相關蛋白(E6 associated protein，E6AP)形成E6-E6AP 復合物，該復合物可與P53 結合形成E6-E6AP-P53 復合物，通過泛素依賴途徑使P53 降解失活，易導致細胞發生惡性轉化［3-4］。該課題組設計并篩選了靶向HPV16 E6 且沉默效應均達95%以上的shRNA，經Agilent 人基因組表達譜芯片分析，發現沉默E6 表達后MUC16 基因表達下調。因此，深入研究E6 與MUC16 的關系，對豐富HPV16 E6的致癌機制，探索HPV16 相關腫瘤新的治療方法具有重要意義。

MUC16 又稱CA125，是卵巢癌的重要標志物。MUC16 在宮頸癌、胰腺癌、卵巢癌組織中均表達增高［5-7］。研究顯示:①MUC16 激活Janus 蛋白酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)-信號轉導和轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號通路，磷酸化的STAT3 能反式激活c-Jun，誘導cyclinD1 表達增加，促進細胞增殖［8］。②MUC16 通過與腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體相互作用，抑制細胞凋亡［9］。③MUC16 高表達可誘導腫瘤細胞侵襲能力增強［10］。

該研究中，Western blot 結果顯示，C-33A 細胞中MUC16 的表達低于SiHa 細胞和CaSki 細胞，CaSki 細胞和SiHa 細胞中MUC16 的表達差異無統計學意義。免疫組化結果顯示，HPV16 E6 陽性宮頸鱗癌組織中MUC16 的表達高于HPV16 E6 陰性宮頸鱗癌組織。說明MUC16 與HPV16 E6 的表達有關，MUC16 在HPV16 相關宮頸癌發生發展中可能發揮重要作用。上述結果也提示在宮頸癌發生發展過程中，E6 和MUC16 之間可能存在直接或間接的調控關系，其詳細調控機制尚有待于進一步研究。

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