五倍子酸對人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

王麗萍，丁 一，劉國紅，石 卓

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 鄭州450001 2)吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 長春130021

△女，1977年9月生，碩士，講師，研究方向:腫瘤藥理學(xué)，E-mail:lp．wang918@126．com

纖維肉瘤是一種最常見的惡性骨腫瘤，目前臨床上主要采用手術(shù)治療，但纖維肉瘤具有手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)。藥物治療在纖維肉瘤的治療中也具有重要作用。五倍子酸(gallic acid，GA)是一種廣泛存在于植物中的多酚類化合物［1］，有學(xué)者［2-3］已證實(shí)其具有較廣泛的藥理作用，在抗腫瘤方面的作用逐漸引起人們的關(guān)注。目前，GA 抗纖維肉瘤的作用尚無相關(guān)報道。作者以人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用MTT 及流式細(xì)胞術(shù)觀察GA對HT1080 細(xì)胞增殖及凋亡的影響，應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察其對Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的影響，探索GA 抗腫瘤作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料 HT1080 細(xì)胞株購自吉林省腫瘤研究所，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長到對數(shù)生長期時使用。GA 購自Sigma 公司，用二甲基亞砜(DMSO)溶解。MTT 購自Sigma 公司，胎牛血清購自杭州四季青生物公司，青霉素、鏈霉素和DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco 公司。

1．2 GA 體外對HT1080 細(xì)胞生長抑制作用的MTT 法測定 取處于對數(shù)生長期的HT1080 細(xì)胞，調(diào)整密度為1 ×105mL－1，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h 后，分別加入不同質(zhì)量濃度的藥物，使其終質(zhì)量濃度分別為3．125、6．250、12．500、25．000、50．000和100．000 mg/L，另設(shè)只加培養(yǎng)液的空白對照組;每組3 復(fù)孔，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2和100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入5 g/L 的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min。酶標(biāo)儀570 nm 波長處測各孔吸光度(A)值，按下式計算細(xì)胞抑制率:細(xì)胞抑制率=(1 －A給藥孔/A對照孔)×100%。

1．3 GA 體外對HT1080 細(xì)胞凋亡的影響 接種對數(shù)生長期的HT1080 細(xì)胞于6 孔板中，培養(yǎng)24 h，加入GA，使其終質(zhì)量濃度分別為6．250、12．500 和25．000 mg/L，以只加培養(yǎng)液的為對照組。培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，離心，棄上清。PBS 離心，洗滌2次。加入體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇4℃固定12 h，離心洗滌后，加入200 μL PI 染液、50 μL RNA 酶，4℃避光放置20～30 min，1 500 r/min 離心5 min，調(diào)整細(xì)胞密度為(1～10)×105mL－1，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1．4 GA 體外對HT1080 細(xì)胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的影響 將HT1080 細(xì)胞培養(yǎng)在內(nèi)有潔凈蓋玻片的6 孔板中，制備細(xì)胞爬片。待其生長到對數(shù)生長期時，實(shí)驗(yàn)組用質(zhì)量濃度分別為6．250、12．500 和25．000 mg/L 的GA 處理，每組均設(shè)10個復(fù)孔。作用48 h 后，按說明書進(jìn)行Bcl-2 和Bax 免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以PBS 代替一抗作陰性對照，一抗均按1∶200稀釋，DAB 顯色。Bcl-2 和Bax 蛋白陽性信號呈棕黃色顆粒樣物質(zhì)，定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果的判定:觀察10個高倍視野，按陽性細(xì)胞數(shù)＜10%、10%～、30%～和70%～分別計為1、2、3、4 分;按著色強(qiáng)度:胞質(zhì)內(nèi)可見淺色顆粒、明顯高于背景底色計為1 分，胞質(zhì)內(nèi)見較深顆粒計為2 分，胞質(zhì)內(nèi)有大量深色顆粒為3 分。上述兩種計分的乘積為最后得分。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15．0 進(jìn)行分析。應(yīng)用單因素方差分析及Dunnet t 檢驗(yàn)比較各組細(xì)胞抑制率、凋亡率及Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 GA 對HT1080 細(xì)胞的生長抑制作用 不同質(zhì)量濃度(3．125、6．250、12．500、25．000、50．000 和100．000 mg/L)的GA 對HT1080 細(xì)胞增殖的抑制率分別為(38．68 ± 3．78)%、(49．87 ± 2．62)%、(61．93 ±4．16)%、(68．34 ± 1．91)%、(76．30 ±3．39)%和(80．20 ±2．12)%，其對HT1080 細(xì)胞以劑量依賴的方式抑制其增殖(F = 71．214，P＜0．001)。

2．2 GA 對HT1080 細(xì)胞凋亡的影響 隨著GA 質(zhì)量濃度(0．000、6．250、12．500 和25．000 mg/L)的增加，HT1080 細(xì)胞的凋亡率增加［(1．57 ±0．72)%、(11．54 ±2．25)%、(25．46 ±1．14)%和(29．35 ±3．27)%］(F=52．217，P＜0．001)。

2．3 各組細(xì)胞Bcl-2 和Bax 蛋白的表達(dá) 見圖1、2和表1。與對照組相比，6．250、12．500 和25．000 mg/L GA組Bcl-2 蛋白表達(dá)均減弱，而Bax 蛋白的表達(dá)均增強(qiáng)。

圖1 GA 作用HT1080 細(xì)胞48 h 后免疫細(xì)胞化學(xué)方法顯示Bcl-2 蛋白表達(dá)變化(×200)

圖2 GA 作用HT1080 細(xì)胞48 h 后免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示Bax 蛋白表達(dá)變化(×200)

表1 4組細(xì)胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的比較

3 討論

細(xì)胞凋亡是一種主動的受基因調(diào)控的細(xì)胞自殺過程。bcl-2 家族是目前研究最深入的凋亡調(diào)控基因，其中bcl-2 和bax 在決定凋亡與否的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［4-6］。bcl-2 是凋亡抑制基因，bax基因作為bcl-2 基因家族的成員，表達(dá)的Bax 蛋白與Bcl-2 蛋白以異源二聚體形式存在，它的生物學(xué)效應(yīng)主要是拮抗Bcl-2，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bcl-2 蛋白家族成員抑制細(xì)胞凋亡的功能，使細(xì)胞凋亡和存活達(dá)到一個相對平衡狀態(tài)。Bax 的高表達(dá)、Bcl-2 的低表達(dá)作用于線粒體，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放，外膜破壞引起線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C、Smac 等凋亡相關(guān)分子大量釋放到細(xì)胞質(zhì)，可以活化Caspase-9，再引起下游的Caspase-3 激活，引起細(xì)胞凋亡［7-9］。

研究［10］報道GA 有誘導(dǎo)4種人肺腫瘤細(xì)胞(小細(xì)胞瘤SBC-3 細(xì)胞、鱗狀細(xì)胞癌EBC-1 細(xì)胞、腺癌A549 細(xì)胞和耐順鉑亞克隆小細(xì)胞癌SBC-3/CDDP細(xì)胞)凋亡的作用，并且GA 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性不隨順鉑耐藥性而改變。還有學(xué)者［11］發(fā)現(xiàn)GA 對卵巢癌SKOV3 細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，并可誘導(dǎo)其凋亡。作者［12］的研究顯示在同等劑量下GA的抑瘤效應(yīng)不如環(huán)磷酰胺，但與環(huán)磷酰胺相比，GA有兩個優(yōu)點(diǎn):一方面GA 對腫瘤細(xì)胞具有選擇性，另一方面GA 對動物的整體毒性低。這些特點(diǎn)均顯示了GA 作為抗腫瘤藥物的良好應(yīng)用前景。

該實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上，以人纖維肉瘤HT1080 細(xì)胞為對象，探討GA 是否能夠在體外抑制HT1080 細(xì)胞的生長，以及抑制其生長的可能機(jī)制。MTT 結(jié)果表明，GA 具有體外抑制HT1080 細(xì)胞生長的作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示隨著GA 質(zhì)量濃度的增高，HT1080 細(xì)胞的凋亡率也增高，提示GA可能是通過誘導(dǎo)HT1080 細(xì)胞的凋亡來抑制其增殖。進(jìn)一步應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測凋亡蛋白Bax 和Bcl-2 的表達(dá)，結(jié)果顯示:與對照組相比，應(yīng)用GA組Bax 蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，而Bcl-2 蛋白的表達(dá)減少。

綜上所述，GA 在體外具有較好的抑制人纖維肉瘤HT1080 細(xì)胞生長的作用，GA 可能通過上調(diào)Bax 和下調(diào)Bcl-2 的表達(dá)，介導(dǎo)其誘導(dǎo)的HT1080 細(xì)胞凋亡。作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為GA 的應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)資料，但體外實(shí)驗(yàn)無法預(yù)測GA 在體內(nèi)的作用，因此還需要從動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床流行病學(xué)等方面進(jìn)一步研究。

［1］Kuo CL，Lai KC，Ma YS，et al．Gallic acid inhibits migration and invasion of SCC-4 human oral cancer cells through actions of NF-kappa B，Ras and matrix metalloproteinase-2 and -9［J］．Oncol Rep，2014，32(1):355

［2］Canbek M，Bayramoglu G，Senturk H，et al．The examination of protective effects of Gallic acid against damage of oxidative stress during induced-experimental renal ischemia-reprefusion in experiment［J］．Bratisl Lek Listy，2014，115(9):557

［3］Mahadeswaraswamy YH，Kumar MS，Gowtham YJ，et al．The polypheno 3，4，5-tri-hydroxy benzoic acid inhibits India daboia russelli venom and its hemorrhagic complex induced local toxicity［J］．Curr Top Med Chem，2011，11(20):2520

［4］吳剛，薛榮亮，呂建瑞，等．全腦缺血再灌注后Fas、TNFR1 蛋白的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及Bcl-2 過度表達(dá)對其的影響［J］．南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，31(8):1298

［5］Sabokrouh A，Goodarzi MT，Vaisi-Raygani A，et al．Effects of treatment with platinum azidothymidine and azidothymidine on telomerase activity and Bcl-2 concentration in hepatocellular carcinoma-induced rats［J］．Avicenna J Med Biotechnol，2014，6(4):200

［6］Lee YJ，Hwang IS，Lee YJ，et al．Knockdown of Bcl-xL enhances growth-inhibiting and apoptosis-inducing effects of resveratrol and clofarabine in malignant mesothelioma h-2452 cells［J］．J Korean Med Sci，2014，29(11):1464

［7］張昭軍，周洋，阿爾孜古麗·吐爾遜，等．左旋棉酚聯(lián)合低濃度阿霉素誘導(dǎo)纖維肉瘤細(xì)胞凋亡及其機(jī)制［J］．重慶醫(yī)學(xué)，2013，42(20):2372

［8］Pan LL，Wang AY，Huang YQ，et al．Mangiferin induces apoptosis by regulating Bcl-2 and Bax expression in the CNE2 nasopharyngeal carcinoma cell line［J］．Asian Pac J Cancer Prev，2014，15(17):7065

［9］Zhao B，He T．Chidamide，a histone deacetylase inhibitor，functions as a tumor inhibitor by modulating the ratio of Bax/Bcl-2 and P21 in pancreatic cancer［J］．Oncol Rep，2015，33(1):304

［10］柯發(fā)敏．沒食子酸的研究進(jìn)展［J］．瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，34(4):440

［11］李文，侯華新，吳華慧，等．沒食子酸對卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的生長抑制作用及機(jī)制［J］．山東醫(yī)藥，2010，50(15):43

［12］王麗萍，曾憲旭，牛鳳蘭，等．五倍子酸對小鼠胃癌MFC和肝癌H22 細(xì)胞增殖的抑制作用［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2012，47(3):339