MLPA技術在22q11．2微缺失綜合征產前診斷中的應用

王莉娜，周世媛，張 華，王鳳羽，謝建生，楊 博，周繼蘋

1)河南省人口和計劃生育科學技術研究院優生遺傳室 鄭州450002 2)深圳市婦幼保健院產前診斷中心 深圳518000 3)鄭州大學第三附屬醫院檢驗科鄭州450052

△女，1979年10月生，碩士，主治醫師，研究方向:出生缺陷干預、產前診斷，E-mail:wangliyana1979@126．com

22q11．2 微缺失綜合征(22q11．2 microdeletion syndrome，22q11．2DS)也稱為顎心面綜合征或Digeorge 綜合征，主要是由于22q11．2 微缺失所致，發病率為1∶4 000［1］。該病患者主要臨床表現是:先天性心臟病(特別是圓錐動脈干畸形)、顎異常、特征性面容、學習困難、免疫缺陷等［2］。該病為常染色體顯性遺傳病，大部分為新發突變［3］。臨床上對該病的治療尚無有效的方法，因此早診斷、早治療非常重要。目前對22q11．2DS 的實驗室診斷主要是采用熒光原位雜交技術(FISH)和多重連接探針擴增技術(MLPA)。2種方法各有優缺點，作者聯合使用2種檢測手段對可疑22q11．2DS 胎兒進行檢測，同時進一步分析22q11．2DS 的基因檢測結果與臨床表現的關系，現將結果報道如下。

1 對象與方法

1．1 研究對象及樣本采集 孕婦，女，30歲，平素月經規律，身體未發現其他異常情況。孕24 周胎兒彩超系統篩查顯示:胎兒心臟發育異常(法洛四聯癥合并房間隔缺損)。孕婦在穿刺前行血常規、凝血四項、傳染病、胎兒超聲等常規檢查。在無發熱、穿刺部位無敏感不適、無凝血異常、胎兒羊水量足夠的情況下，告知相關風險，孕婦簽署知情同意書后行羊膜腔穿刺。然后采集孕婦及其丈夫的全血樣本。

1．2 樣本處理

1．2．1 羊水樣本DNA 提取 取5 mL 羊水樣本，3 000 r/min 離心10 min，棄上清，利用Thermo Scientific King Fisher 自動磁珠提取純化儀從羊水胎兒脫落細胞提取基因組DNA。

1．2．2 全血樣本DNA 提取 取200 μL 全血樣本，利用Thermo Scientific King Fisher 自動磁珠提取純化儀從全血中提取基因組DNA。

1．3 實驗方法 羊水和全血樣本進行常規染色體核型分析的同時，另取準備好的羊水樣本和全血樣本的基因組DNA 進行MLPA 檢測，異常結果的樣本再進行FISH 檢測。

1．3．1 MLPA 檢測 采用荷蘭MRC-Holland 公司的微缺失檢測試劑盒進行檢測。將準備好的基因組DNA 依次進行變性、雜交、MLPA 連接反應和常規PCR，最后將PCR 反應產物在CEQ8800 Genetic Analysis 分析儀進行電泳。CEQ8800 Genetic Analysis分析儀收集熒光信號并自動生成MLPA 圖譜。用MRC-Holland 公司提供的GeneMarker 軟件對圖譜進行分析。

1．3．2 羊水、全血培養后染色體核型分析 羊水、全血培養后按照常規步驟進行染色體核型分析［4］。

1．3．3 FISH 檢測 采用雙色熒光探針進行檢測。目標基因為22q11．2 區域的TUPLE1 基因，顯示紅色熒光信號;對照基因為22q13．3 區域的ARSA 基因，顯示綠色熒光信號。按照FISH 常規操作程序進行制片、干燥、變性、雜交、后洗、染色和鏡檢。

2 結果

2．1 常規染色體核型分析結果 羊水和全血樣本常規染色體核型分析結果顯示，均未發現明顯的結構和數目異常。

2．2 MLPA 檢測結果 與22q11．2DS 相關的探針有6個，胎兒的電泳圖(圖1)顯示，22q11．21 區域196、208、371 信號均降低約0．5。胎兒父母的電泳圖中未見異常。

圖1 MLPA 檢測擴增電泳圖

2．3 FISH 檢測結果 正常細胞顯示:單個中期細胞核中紅色信號及綠色信號均為2個。異常細胞顯示:紅色信號1個，綠色信號2個，表示TUPLE1 基因發生缺失;紅色信號2個，綠色信號1個，表示ARSA 基因發生缺失。FISH 檢測結果顯示為TUPLE1 基因發生缺失(圖2)。

圖2 FISH 檢測羊水樣本的熒光圖(×1 000)

3 討論

先天性心臟病是一類因胚胎期心血管系統發育異常所引起的先天性的畸形，是我國出生缺陷檢測的重大疾病之一。病因有三大類:遺傳、環境、遺傳與環境共同作用。其中遺傳因素中常見的是染色體異常(如21 三體綜合征和18 三體綜合征)，現有研究［5］證實22q11．2DS 是最常見的引起先天性心臟病的遺傳因素之一。對于22q11．2DS 的診斷，細胞遺傳學水平的檢測不能滿足臨床的需要。該實驗常規細胞染色體核型分析結果顯示全血和胎兒樣本的染色體核型分析均正常，無法檢測到22q11．2DS。目前檢測22q11．2DS 的方法還有FISH 檢測、MLPA 檢測和全基因組微陣列檢測。FISH 檢測因其探針數有限，僅能檢測到與探針相對應的缺失，該實驗中FISH 方法僅檢測TUPLE1 基因缺失;但是FISH 技術對操作者的技術和實驗環境的要求相對較高。而全基因組微陣列技術無論對人員還是對設備要求均較高。MLPA技術將DNA 探針技術和PCR 技術相結合，能夠快速、高通量、方便、精確地檢測出基因變異和變異位點［6］。該實驗采用MLPA 技術進行檢測，結果尋找到了3種與22q11．2DS 致病相關的信號，增加了對22q11．2DS 致病機制研究的信息量。

22q11．2DS 的臨床表現復雜多樣，目前已經報道的表型有180種之多。這些表型在各個患者的表現存在較大的個體差異。22q11．2DS 的臨床表現還有一定的時間差異性，即隨著個體的發育逐漸顯現出來［7］。該實驗MLPA 檢測結果顯示22q11．21 區域196、208、371信號均降低，196信號相對應的是CLDN5 基因，208 信號相對應的是GP1BB 基因，371信號相對應的是SNAP29 基因。研究資料［8］顯示，CLDN5 基因與眼部疾病有關。GP1BB 和SNAP29 基因是診斷22q11．2DS 的關鍵基因［9］，與先天性心臟畸形的發生有很大相關性［10-11］。通過MLPA 對22q11．2DS的檢測可為22q11．2DS 胎兒的心外畸形推測、手術風險評估、治療方案選擇［12］等提供更多有用信息。

74%的22q11．2DS 患有先天性疾病，特別是圓錐動脈干畸形［2］。有研究［13］認為:先天性心臟病患者，無論是否合并有其他畸形或異常，均應進行22q11．2DS 的檢測。22q11．2DS 攜帶者，無論其臨床表現如何，其后代獲得這一染色體異常的幾率都是50%，并且后代有可能表現為嚴重的綜合征。因此及時、準確地進行產前診斷可以有效避免這種缺陷患兒的出生，尤其是對先天性心臟病高危妊娠的婦女。當胎兒或患兒有相關缺失時，均應對其父母進行同樣的檢測，以便為其進行再發風險遺傳咨詢。該實驗采用的MLPA 技術無論從技術操作還是從人力、物力上均可達到臨床檢測的要求。

綜上所述，與FISH 技術相比，MLPA 技術能夠及時、準確診斷22q11．2DS，為其后續的治療和預后判斷提供了大量的信息。

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