葛根芩連湯對(duì)慢性牙周炎合并動(dòng)脈粥樣硬化大鼠TNF-α水平的影響*

李文娟，彭 偉，王 丹，方 謙，周 雪

河北聯(lián)合大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院唐山063000

△女，1987年6月生，碩士研究生，醫(yī)師，研究方向:口腔內(nèi)科學(xué)，E-mail:562649611@qq．com

近年來(lái)慢性牙周炎和心血管疾病的關(guān)系備受關(guān)注。資料［1］表明，冠心病和外周動(dòng)脈粥樣硬化的患者口腔衛(wèi)生不良率和牙周炎患病率均較高，牙周炎患者中冠心病的發(fā)病率明顯增加。慢性炎癥可增加心血管疾病患者動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)，炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、斑塊發(fā)展、斑塊破裂過(guò)程中起著重要作用［2-5］，并在一定程度上決定著粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性和自然進(jìn)程。對(duì)于牙周炎目前多采用手術(shù)治療、基礎(chǔ)治療配合藥物治療，但是心血管疾病患者對(duì)手術(shù)和基礎(chǔ)治療往往不耐受。中藥復(fù)方制劑因含多種成分，具有多方位的綜合效用，如抗菌譜廣、高效、低毒、廉價(jià)、取材廣泛等。作者采用中藥葛根芩連湯對(duì)慢性牙周炎合并動(dòng)脈粥樣硬化的大鼠模型進(jìn)行治療，并觀察其對(duì)牙周組織及血清TNF-α 水平的影響，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要材料 Wistar 大鼠，雄性，體重(200 ±20)g(北京華阜康生物科技股份有限公司);葛根芩連湯合劑:由葛根(批號(hào)1110035)、黃芩(批號(hào)1202152)、黃連(批號(hào)1111019)、炙甘草(批號(hào)1112083)中藥配方顆粒(葛根15 g、黃芩9 g、黃連9 g、炙甘草6 g，廣州一方制藥有限公司)組成，唐山市中醫(yī)醫(yī)院提供;甲硝唑片(亞寶藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)111020)，阿托伐他汀片(北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)H20093819);大鼠TNF-α 多克隆抗體(博奧森科技有限公司)，PV-6001 二步法免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);酶標(biāo)儀、Olympus 顯微鏡等。

1．2 動(dòng)物分組及模型建立 40只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為2組:對(duì)照組(N組)10只、模型組(D組)30只。D組:將左上頜第二磨牙牙周結(jié)扎，高脂飲食輔助藥物誘導(dǎo)，持續(xù)12 周，建立慢性牙周炎合并動(dòng)脈粥樣硬化模型［6］。N組:不進(jìn)行上述處理。12 周末N組和D組均處死5只大鼠，HE 染色觀察牙周組織和腹主動(dòng)脈病理變化，驗(yàn)證造模結(jié)果。造模成功后將D組大鼠分成5組:鹽水治療組(D1組)、甲硝唑治療組(D2組)、阿托伐他汀治療組(D3組)、甲硝唑聯(lián)合阿托伐他汀治療組(D4組)、葛根芩連湯治療組(D5組)，每組5只大鼠。甲硝唑用量0．05 g/(kg·d)，阿托伐他汀用量0．08 g/(kg·d)，葛根芩連湯用量0．42 g/(kg·d)［7］;N組、D1組灌胃生理鹽水;所有動(dòng)物灌胃體積不超過(guò)4 mL/(kg·d)，每天灌胃1次，灌胃4 周后，處死所有動(dòng)物。

1．3 牙周組織和腹主動(dòng)脈標(biāo)本采集及HE 染色觀察 分別于實(shí)驗(yàn)第12、16 周取動(dòng)物上頜標(biāo)本，經(jīng)生理鹽水清洗后，40 g/L 多聚甲醛溶液固定48 h 以上，在滴水條件下進(jìn)行組織修整，放入100 g/L EDTA 脫鈣液(pH=7．3)4℃水浴脫鈣4 周，常規(guī)石蠟包埋，沿牙周組織塊頰舌向切片，片厚5 μm。取腹主動(dòng)脈段置體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中保存，石蠟包埋、切片。上述標(biāo)本分別進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1．4 免疫組化法觀察牙周組織和腹主動(dòng)脈中TNFα 的表達(dá) 采用免疫組化PV 二步法觀察TNF-α 在牙周組織和腹主動(dòng)脈中的表達(dá)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作，應(yīng)用Image-Pro Plus 6．0 計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)半定量分析TNF-α 的表達(dá)水平。

1．5 血清TNF-α 水平檢測(cè) 分別于第12 和16 周末時(shí)，各組動(dòng)物禁食12 h，采腹主動(dòng)脈血5 mL，離心取上清，用ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中TNF-α 水平。嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同組間牙周組織和腹主動(dòng)脈中TNF-α 的表達(dá)水平及血清中TNF-α 水平的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0．05。

2 結(jié)果

2．1 牙周組織和腹主動(dòng)脈HE 染色結(jié)果 見(jiàn)圖1。N組:牙齦上皮結(jié)構(gòu)完整，結(jié)合上皮、溝內(nèi)上皮結(jié)構(gòu)正常，牙周膜纖維排列整齊，牙槽嵴處未見(jiàn)骨吸收;血管管壁均勻一致，沒(méi)有內(nèi)層增生。D組:牙周炎癥破壞明顯，結(jié)合上皮與牙面分離，上皮向根方增殖，組織深部可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，骨小梁稀疏，牙槽骨表面可見(jiàn)骨吸收，牙槽嵴頂高度降低，呈垂直吸收，牙周膜纖維粗細(xì)不均或斷裂，排列紊亂;腹主動(dòng)脈內(nèi)層增厚，管腔明顯縮窄，出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。D5組治療4 周后，牙周組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)比D1組明顯減少，牙槽嵴吸收程度減輕，牙齦上皮炎癥有不同程度的減輕，牙周膜纖維排列較整齊;腹主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度變薄，增生不明顯。D2組、D3組、D4組牙周組織炎癥均減輕。

2．2 牙周組織和腹主動(dòng)脈中TNF-α 的表達(dá) 結(jié)果見(jiàn)圖2、表1。

圖1 各組大鼠牙周組織(1)和腹主動(dòng)脈(2)病理變化(HE，×200)

圖2 各組大鼠牙周組織(1)和腹主動(dòng)脈(2)TNF-α 的表達(dá)(PV，×400)

表1 各組大鼠牙周組織和腹主動(dòng)脈中TNF-α 的相對(duì)表達(dá)量

2．3 血清TNF-α 水平檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α 水平比較 ng/L

3 討論

葛根芩連湯最早出自漢代張仲景《傷寒論》，是具有祛邪、升清、生津之功效的經(jīng)典名方。葛根素被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的預(yù)防及治療［8］，研究［9］還發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)成骨細(xì)胞合成和分泌堿性磷酸酶的作用，同時(shí)可以造成體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞空泡性變、骨吸收陷窩面積減少等。配方中黃芩的有效成分具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基的作用，并對(duì)免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)有保護(hù)作用［10］。Tsao 等［11］研究證實(shí)，黃芩煎劑對(duì)多種牙周病病原菌有抑制作用;湯亞玲等［12］研究證實(shí)，黃芩水浸膏具有抑制牙髓卟啉單胞菌生長(zhǎng)、降解LPS 的作用。另有研究［13］發(fā)現(xiàn)，黃芩提取物能阻斷牙周炎癥過(guò)程，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，并能明顯抑制LPS 引起的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成。配方中的黃連含有多種生物堿成分，其中的小檗堿具有預(yù)防頸動(dòng)脈粥樣硬化的作用［14］。黃連素通過(guò)提高低密度脂蛋白受體的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)降脂作用［15］，在臨床上黃連素治療高脂血癥已取得了確切的療效［16-17］。

在心血管系統(tǒng)疾病中，TNF-α 可以通過(guò)改變鈣離子平衡、氧化張力、破壞興奮-收縮偶聯(lián)等方式導(dǎo)致心肌功能障礙。在牙周病中，TNF-α 可以作為始動(dòng)因子引發(fā)炎癥反應(yīng);誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的產(chǎn)生，引發(fā)牙槽骨吸收;增加基質(zhì)金屬蛋白酶的生成，破壞膠原纖維;誘發(fā)基質(zhì)細(xì)胞凋亡，阻礙牙周組織的修復(fù)等等。由于TNF-α 在兩種疾病中發(fā)揮重要作用，因此以TNF-α 為靶點(diǎn)的治療十分有意義。中藥復(fù)方制劑因含多種成分，具有多方位的綜合效用。在此實(shí)驗(yàn)中，作者選用了西藥阿托伐他汀、甲硝唑、甲硝唑聯(lián)合阿托伐他汀作為對(duì)照藥，結(jié)果顯示D5組炎癥因子水平低于各西藥單純用藥組，與聯(lián)合用藥組治療效果相似。但是長(zhǎng)期使用廣譜抗生素和化學(xué)合成藥在清除致病菌的同時(shí)，也會(huì)破壞口腔的微生態(tài)平衡，導(dǎo)致多種毒副作用。故對(duì)于牙周炎合并動(dòng)脈粥樣硬化的慢性炎癥性疾病的治療，選擇天然植物藥具有良好的應(yīng)用前景。該實(shí)驗(yàn)采用葛根芩連湯對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示D5組、D2組、D3組以及D4組牙周組織和腹主動(dòng)脈以及血清中TNF-α 水平均較D1組明顯降低。說(shuō)明葛根芩連湯能降低牙周炎合并動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠TNF-α 水平，對(duì)牙周炎合并動(dòng)脈粥樣硬化大鼠有很好的治療效果，提示牙周炎與動(dòng)脈硬化同時(shí)治療有利于改善機(jī)體的炎癥狀態(tài)及心血管功能。

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