人臍帶間充質干細胞移植對老年癡呆小鼠腦、肝組織中衰老相關基因表達的影響*

崔淵博，馬珊珊，姚 寧，渠瑞娜，王欣欣，邢 衢，孟 楠，楊 波#，關方霞#

1)鄭州大學生命科學學院 鄭州450001 2)鄭州大學第一附屬醫院神經外科 鄭州450052

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種中樞神經系統退行性疾病，主要臨床表現為進行性學習記憶能力減退、空間認知功能障礙以及人格和行為改變等癥狀，病因迄今未明。APP+轉基因鼠模型能夠較好地模擬AD 的臨床特征。人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是來源于人體臍帶沃頓膠組織中的多能干細胞，具有分離培養簡易、自我更新能力強和分化潛能多向等特點［1］。研究［2-3］發現hUCMSCs 在體內外條件下可誘導分化為神經元樣細胞，為AD 的治療帶來新的希望。課題組前期研究［3］發現間充質干細胞尾靜脈移植治療AD APP+轉基因鼠能夠明顯改善小鼠的學習記憶能力，并且安全有效，但其分子機制并不十分清楚。關于衰老的機制有自由基學說、端粒酶學說、遺傳程序學說等多種學說。已有研究［4］發現，某些基因與細胞衰老過程密切相關，可將它們概括為細胞周期調控基因、端粒酶調控基因、生長抑制基因以及核酸、蛋白質合成與修復基因等;另外，衰老還與一些反式作用轉錄因子基因的活性變化有關，其中有抑癌基因p16、p53、p21、沉默信息調節因子家族(Sirtuins)、增殖細胞核抗原(PCNA)等。這些衰老相關基因之間相互聯系，可能構成細胞衰老的基因調控鏈。該研究利用APP+轉基因鼠為實驗對象，觀察hUC-MSCs 移植對其學習記憶能力及組織內衰老相關基因表達的影響，從行為學水平和分子水平兩個方面探討hUC-MSCs 靜脈移植延緩APP+轉基因鼠衰老的作用機制。

1 材料與方法

1．1 材料試劑 實驗所用hUC-MSCs 由課題組前期凍存。DMEM/F12 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液、膠原酶Ⅳ、購自鼎國昌盛生物技術公司，逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR SYBR Premix 試劑盒購自TaKaRa 公司，APP 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，兔抗人Sirt2、PCNA、p16、p21、p53 多克隆抗體均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1．2 APP 轉基因小鼠的鑒定和分組 清潔級C57BL/6 APP 轉基因鼠購自中國協和醫科大學動物所，合籠繁殖。采用PCR 方法對出生后的APP 轉基因小鼠進行分子生物學鑒定。剪取0．5 cm 左右小鼠尾巴，提取DNA，PCR 擴增APP 基因，鑒定APP+轉基因鼠。APP 基因上游引物序列5'-CCCT GAACCTGAAACATAAAAT-3'，下游引物序列5'-GC TACGAAAATCCAACCTACAA-3'。APP+轉基因鼠隨機分為hUC-MSCs 移植組和對照組，每組6只。

1．3 hUC-MSCs 的移植 復蘇并傳代培養hUCMSCs，傳至第3 代用DMEM/F12 培養基將細胞調成密度為1 ×106mL－1的細胞懸液;移植組中的每只APP+轉基因鼠經尾靜脈注射細胞懸液0．5 mL，對照組APP+轉基因鼠經尾靜脈注射同等體積的生理鹽水。

1．4 小鼠學習記憶能力的Morris 水迷宮實驗檢測

1．4．1 準備及適應訓練 小鼠專用水迷宮水池直徑120 cm，高40 cm，分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個象限。平臺放在第Ⅰ象限水中的中心位置，平臺直徑15 cm，水溫控制為(25 ±1)℃。正式實驗前1 周為適應練習期。在整個實驗過程中，水迷宮位置、方向及周圍環境保持不變。每只小鼠每天入水訓練2次，間隔時間由其他小鼠進行訓練，適應訓練過程持續1 周。

1．4．2 空間探索測試 從細胞移植第5 周結束起，開始進行正式實驗。將適應訓練后的小鼠以組為單位依次從4個不同象限放入水池中，觀察并記錄小鼠游泳軌跡。利用攝像采集器記錄下3個參數:穿越平臺次數、逃避潛伏期(從入水開始到找到平臺所用時間)和在平臺所在象限停留時間。

1．4．3 反向探索測試 反向探索測試階段，將平臺位置對調放置于第Ⅳ象限中心位置。測試方法同空間探索測試，依次將每只鼠從4個不同象限放入水池中，觀察小鼠游泳軌跡。記錄上述3個參數。

1．5 各組小鼠腦、肝組織中衰老相關基因mRNA表達的熒光定量PCR 檢測 Morris 水迷宮實驗結束后，移植組和對照組小鼠各選3只，處死小鼠，取出腦及肝臟組織，加入液氮后研磨，用Trizol 裂解組織提取總RNA，具體操作按照說明書進行。然后取1 μL RNA 樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性、濃度和純度，分裝后－80℃保存備用。利用逆轉錄試劑盒，取1 μg 總RNA 反轉錄為cDNA。以小鼠GAPDH 作為內參，按照熒光定量PCR 試劑盒說明書配制反應體系，利用Fast 7500 Real Time System進行實時熒光定量PCR，每個樣品設3個復孔。反應條件為95℃30 s，95℃3 s，60℃30 s，40個循環。反應結束后觀察記錄擴增曲線和熔解曲線。數據分析采用比較CT 法(ΔΔCT)，相對表達量(RQ)=2－ΔΔCT，取3次平均值作圖。實驗所用相關引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR 引物序列

1．6 各組小鼠腦、肝組織中衰老相關蛋白表達的Western blot 檢測 收集各組小鼠的腦組織和肝臟組織，提取總蛋白，測蛋白濃度。取100 μg 總蛋白加入5×上樣緩沖液，沸水中煮10 min，再迅速冰浴5 min，分裝后置于－20℃保存備用。經SDS-PAGE 凝膠電泳及轉膜后用P16、P21、P53、Sirt2 和PCNA 抗體雜交，采用ECL 化學發光法檢測，晾干后掃描結果。1．7 統計學處理 采用SPSS 17．0 進行分析。應用兩獨立樣本t 檢驗分析2組小鼠腦組織和肝臟組織中衰老相關基因mRNA 及蛋白相對表達量的差異。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 APP+轉基因鼠的鑒定 5月齡APP 轉基因鼠經PCR 擴增APP 基因進行分子生物學鑒定，電泳結果顯示擴增出284 bp 條帶的為APP+轉基因鼠，該實驗共獲得12只鼠。

2．2 APP+轉基因鼠學習記憶能力檢測 見表2。與對照組相比，移植組APP+轉基因鼠逃避潛伏期時間縮短、穿越平臺次數增加，在平臺所在象限停留的時間延長。

表2 hUC-MSCs 移植后2組小鼠水迷宮測試結果

2．3 2組小鼠腦、肝組織中衰老相關基因表達的變化 見圖1 和表3、4。與對照組相比，移植組小鼠腦組織中p21、p53 mRNA 和蛋白的表達降低，PCNA、Sirt2 mRNA 和蛋白的表達升高，而p16 的表達變化不明顯。

2．4 2組小鼠肝組織中衰老相關基因表達的變化見圖2 和表5、6。移植組小鼠肝組織中PCNA、Sirt2 mRNA 和蛋白的表達明顯高于對照組，p21、p53 mRNA 和蛋白的表達顯著低于對照組，差異具有統計學意義，而p16 表達的變化不明顯。

圖1 2組小鼠腦組織中衰老相關蛋白表達的變化

表3 2組小鼠腦組織中衰老相關基因mRNA 表達的變化

表4 2組小鼠腦組織中衰老相關蛋白表達的變化

圖2 各組小鼠肝組織中衰老相關蛋白表達的變化

表5 各組小鼠肝組織中衰老相關基因mRNA 表達的變化

表6 各組小鼠肝組織中衰老相關蛋白表達的變化

3 討論

隨著AD 的發病率逐年上升，尋找有效治療AD的方法顯得尤為迫切。近年來，干細胞在神經系統退行性疾病的研究和應用取得了令人鼓舞的進展［5］。研究［6］表明神經干細胞移植能夠顯著改善APP+轉基因鼠學習記憶功能。但神經干細胞受標本來源及細胞擴增數量的影響，骨髓干細胞不適合從年幼或高齡患者采集。In't Anker 等［7］從臍帶中培養出臍帶MSCs，經免疫表型鑒定與骨髓來源的MSCs 相似，且比骨髓來源的MSCs 具有更強的擴增能力和分化能力，而且不存在倫理學和免疫排斥等問題，對中樞神經系統損傷具有良好的神經修復作用［8］，從而為組織工程、細胞工程和干細胞治療提供新的干細胞來源。近年來，隨著分子生物學技術的發展，已經發現某些基因與細胞衰老密切相關。衰老的細胞停滯于G 期，不能順利進入S 期。細胞周期的停滯是細胞衰老的前提，細胞衰老伴隨著細胞形態改變和相關基因表達的變化。調控細胞周期主要有兩個信號通路［9］:一條是損傷信號激活了P53，P53 激活P21，P21 抑制CDK2 導致pRb 去磷酸化，最終導致細胞衰老［10-11］;另一條途徑是某些衰老信號激活了P16，P16 抑制CDK4/6 導致pRb去磷酸化，影響細胞周期，從而導致細胞衰老［12］。

研究［13］表明p16 基因過表達可抑制293 細胞的增殖，將細胞周期阻滯在G0/G1期，促進細胞衰老。除此之外，PCNA 作為DNA 聚合酶的附屬蛋白，能夠增加DNA 聚合酶活性，在DNA 復制和細胞的分裂增殖中發揮作用。Sirt2 能夠介導端粒及核糖體基因簇的轉錄沉默，參與大量與衰老有關的病理生理過程［14］，有利于防止細胞早衰和過分化。

在該研究中，作者將hUC-MSCs 靜脈移植APP+轉基因鼠，發現在腦組織和肝組織細胞中存在P21、P53 表達的降低和PCNA、Sirt2 表達的升高，而P16表達變化不明顯。該研究結果提示MSCs 調控細胞衰老的機制可能主要是通過P53/P21 信號通路，而不是P16 信號通路。移植后3 周經Morris 水迷宮實驗測定，移植組平均穿越平臺次數明顯增加，逃避潛伏期時間明顯縮短，即學習記憶能力明顯改善。該研究表明hUC-MSCs 通過調控細胞中衰老相關基因的表達進而影響細胞衰老過程，改善APP+轉基因鼠的學習記憶功能，這可能是hUC-MSCs 延緩APP+轉基因鼠衰老的機制之一。該研究將為從基因角度探討生命衰老發生機制及尋找有效治療AD 方法提供依據。

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