HPV16相關宮頸癌細胞系和組織中E7和DRR1蛋白的表達*

王 虹，李 娜，付琳琳，吳 余，田明振，李 航，馮思佳，楊 璐，趙二趁，千新來

新鄉醫學院病理學教研室新鄉453003

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，約80%是鱗狀細胞癌［1］。世界范圍內每年有50 萬新增宮頸癌病例，死亡27．4 萬例［2］。人乳頭瘤病毒(human papilloma viruses，HPVs)感染是引起宮頸癌和癌前病變的主要原因［3］，在15個高危HPVs 中，HPV16是目前最主要的類型［4］。早起基因E7 編碼的E7蛋白持續表達是高危HPVs 致癌的關鍵，其可通過結合并降解pRb 蛋白等，導致細胞異常增殖［5］。人腎細胞癌下調基因1(down-regulated in renal cell carcinoma 1，DRR1)定位于染色體的3p21．1，其蛋白產物廣泛表達于正常組織，但在許多癌細胞系和原發性腫瘤組織中表達明顯降低，如腎細胞癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌、非小細胞肺癌等［6］。DRR1 作為腫瘤抑制基因可能在細胞癌變過程中發揮重要作用［7］。該研究從細胞和組織水平檢測DRR1 表達與E7 表達的關系，試圖為HPV16 相關宮頸癌的治療提供新的線索。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細胞系及培養條件 HPV16 陽性的宮頸癌CaSki 細胞和SiHa 細胞，以及HPV16 陰性的宮頸癌C-33A 細胞均購自中科院上海細胞庫。培養條件:高糖DMEM 培養基(美國Invitrogen 公司)，內含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素，于37℃、體積分數5%CO2孵箱中培養。

1．1．2 宮頸癌標本的收集與處理 從新鄉市第一人民醫院和新鄉醫學院第三附屬醫院收集宮頸鱗狀細胞癌組織標本，共184例，每例標本常規制備石蠟切片3 張，1 張用于HE 染色以進一步確診，其余2張用于HPV16 E7 和DRR1 蛋白的檢測。

1．1．3 主要試劑及儀器 鼠抗人β-actin 單克隆抗體、鼠抗人HPV16 E7 單克隆抗體、ECL 試劑盒和辣根酶標記的兔抗鼠二抗購自美國Santa Cruz 公司，鼠抗人DRR1 單克隆抗體為武漢博士德生物工程有限公司產品。通用型PV9000 二步法免疫組化檢測試劑盒購自美國Zymed 公司。超凈工作臺(SW-CJ-1F)購自蘇州凈化設備有限公司，倒置顯微鏡(TE2000-U)購自日本Nikon 公司，半干轉膜儀(TE-70)購自美國Amersham Biosciences 公司，微波爐購自廣東格蘭仕公司。

1．2 宮頸癌細胞中HPV16 E7 和DRR1 蛋白的檢測 采用Western blot 方法檢測。收集CaSki、SiHa和C-33A 細胞，提取細胞總蛋白，按Bradford 方法進行定量，變性處理后進行SDS-PAGE 和轉膜，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗室溫搖育2 h，二抗室溫搖育2 h，按照ECL 試劑盒操作步驟進行顯色、曝光，最后顯影、定影、掃描。以β-actin 為內參照。蛋白上樣量均為150 μg，鼠抗人β-actin 單克隆抗體、鼠抗人HPV16 E7 單克隆抗體、鼠抗人DRR1 單克隆抗體、辣根酶標記的兔抗鼠二抗的稀釋倍數分別為1 000、300、500 和5 000。采用Bandscan 5．0 軟件分析，以目的條帶與內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1．3 宮頸鱗狀細胞癌組織中HPV16 E7 和DRR1蛋白的檢測 采用免疫組化染色法檢測。石蠟切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，于微波爐中進行抗原修復。體積分數3%H2O2中室溫封閉20 min，山羊血清室溫封閉20 min。滴加稀釋好的一抗(HPV16 E7 和DRR1 一抗稀釋倍數均為50)，4℃孵育過夜。滴加通用型IgG 抗體-辣根過氧化物酶多聚體，室溫孵育30 min。DAB 顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。以PBS 代替一抗作為陰性對照。HPV16 E7 和DRR1 蛋白主要定位于細胞核，陽性信號呈棕黃色顆粒樣著色。高倍鏡下選取5個視野進行觀察:①按陽性細胞百分比計分，＜30%、30%～70%及＞70%各記為1、2 和3 分。②按切片中細胞著色深淺評分，無著色和淺黃色、棕黃色、棕褐色著色各記為0 分和1、2、3 分。取兩項評分之和作為總積分，總積分0～1 分為陰性，≥2 分為陽性。

1．4 統計學處理 使用SPSS 16．0 進行分析。3種細胞中DRR1 蛋白表達的比較采用單因素方差分析及LSD-t 檢驗;宮頸鱗狀細胞癌組織中DRR1 和HPV16 E7 蛋白表達的分析采用χ2檢驗;檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 宮頸癌細胞中HPV16 E7 和DRR1 蛋白的表達 見圖1、表1。C-33A 細胞中未見HPV16 E7 蛋白表達，CaSki 和SiHa 細胞中可見HPV16 E7 蛋白表達。C-33A 細胞中DRR1 蛋白表達顯著高于CaSki和SiHa 細胞，CaSki 細胞和SiHa 細胞中DRR1 蛋白的表達差異無統計學意義。

圖1 宮頸癌細胞中HPV16 E7(上)和DRR1(下)蛋白的表達

表1 宮頸癌細胞中DRR1 蛋白的表達

2．2 宮頸鱗狀細胞癌組織中HPV16 E7 和DRR1蛋白的表達 宮頸鱗狀細胞癌組織184例，其中HPV16 E7 陽性141例，陰性43例(圖2)。HPV16 E7 陽性宮頸鱗狀細胞癌組織中DRR1 蛋白的表達顯著低于HPV16 E7 陰性組織，見圖2、表2。

圖2 宮頸鱗狀細胞癌組織中HPV16 E7 和DRR1 蛋白的表達(SP，×400)

表2 宮頸鱗狀細胞癌組織中HPV16 E7 和DRR1 蛋白的表達例

3 討論

高危型HPVs 感染是宮頸癌的主要病因，全球超過一半的病例由HPV16 感染引起［8］。高危型HPVs 的早起基因E7 表達的E7 蛋白可直接使pRb失活，因此，E7 是強有力的細胞增殖誘導者，其可顯著降低基因組的穩定性，使宿主細胞傾向于向腫瘤發展，E7 被認為是宮頸癌診斷和治療的靶點［9］。目前尚沒有可用于HPVs 相關疾病治療的有效方法［10］，宮頸癌治療多采用綜合治療方案。因此，深入研究HPV16 的致癌機制對探索HPV16 相關腫瘤新的治療方法具有重要意義。

人DRR1 基因最初由Yamato 等克隆得到，用突變型DRR1 轉染腎細胞癌和其他腫瘤細胞系可以抑制細胞增殖。DRR1 的再表達可抑制癌細胞的生長并誘導細胞凋亡［11］。轉染該基因到DRR1 陰性的癌細胞系中可觀察到明顯的細胞生長阻滯［12］。因此，DRR1 作為腫瘤抑制基因可能在癌變過程中發揮重要作用。

該研究中，Western blot 結果顯示:C-33A 細胞不表達HPV16 E7 蛋白，其DRR1 的表達顯著高于CaSki 細胞和SiHa 細胞;CaSki 細胞和SiHa 細胞表達HPV16 E7 蛋白，二者DRR1 蛋白的表達差異無統計學意義。免疫組化結果顯示:HPV16 E7 蛋白陽性的宮頸鱗狀細胞癌組織中DRR1 蛋白的表達顯著低于HPV16 E7 陰性組織。上述結果說明無論是宮頸癌細胞系還是宮頸癌組織，E7 與DRR1 的表達均呈負相關。據此初步推測，在宮頸癌發生發展過程中，HPV16 E7 可能通過直接或間接抑制DRR1 的表達而發揮其致癌作用，關于E7 與DRR1 具體的相互作用機制還有待進一步研究。

綜上所述，DRR1 可能是HPV16 E7 作用的潛在靶基因，在宮頸癌的發生發展中起重要作用，在HPVs 相關腫瘤的治療上可能有廣泛的應用前景。

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