高壓氧對孤獨癥大鼠行為及外周血IL-1β、IL-6和IL-10水平的影響*

劉仕成，賈飛勇，徐乃軍，夏天亮，張麗萍，姜慧軼#

1)吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科 長春130021 2)吉林大學(xué)第一醫(yī)院小兒康復(fù)科 長春130021 3)吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部兒科 長春130031 4)吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部急診科 長春130031 5)吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 長春130021

孤獨癥譜系障礙(簡稱孤獨癥)是影響兒童成長發(fā)育的重要疾病之一，目前已經(jīng)引起全世界各個國家的重視。2012年美國疾病預(yù)防控制中心數(shù)據(jù)［1］顯示，孤獨癥自首次報道以來其發(fā)病率呈現(xiàn)日益增長的趨勢，患病率約為1．4%。然而孤獨癥目前尚無特效療法。有研究［2］發(fā)現(xiàn)，采用高壓氧治療孤獨癥能夠改善患兒煩躁、多動、刻板等行為，提高患兒的語言能力，但是其作用機(jī)制尚不清楚。高壓氧作為一種無創(chuàng)性的治療手段，目前已被應(yīng)用于多個領(lǐng)域，它不但有助于增加機(jī)體血氧含量、降低血黏度、改善腦循環(huán)、減輕腦水腫及腦細(xì)胞的損害，還能夠在某種程度上抑制細(xì)胞因子的釋放。有研究［3-4］報道，胎兒期細(xì)胞因子水平的失調(diào)可能是孤獨癥發(fā)生的原因之一。該研究擬建立孤獨癥大鼠模型，比較孤獨癥模型鼠和正常對照鼠的行為及外周血中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 和IL-10 水平的差異，并探討高壓氧治療孤獨癥的可能機(jī)制，為高壓氧治療孤獨癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物、主要試劑和儀器 健康成年Wistar雄性大鼠50只，體重(300 ±50)g，雌性大鼠50只，體重(250 ±50)g，購自吉林大學(xué)實驗動物部，動物合格證號:SCK(吉2008-0005)。所有實驗動物的喂養(yǎng)及實驗程序均嚴(yán)格遵照吉林大學(xué)實驗動物保護(hù)條款。丙戊酸鈉(VPA)為美國Sigma 公司產(chǎn)品，IL-1β、IL-6 和IL-10 測定試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。曠場實驗及EthoVision 影像跟蹤系統(tǒng)由荷蘭Noldus 公司提供，有機(jī)玻璃箱為長春有機(jī)玻璃廠制作，程控避暗箱為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供，刻板行為檢查裝置為自制，動物實驗用高壓氧艙由吉林大學(xué)第一醫(yī)院高壓氧科提供。

1．2 VPA 孤獨癥大鼠模型的制備與實驗分組 參照Schneider 等［5］的方法建立和評價孤獨癥動物模型。將育齡雌性與雄性Wistar 大鼠合籠交配繁殖，次日晨檢查到陰栓的雌鼠記為受孕第1天。第12．5天，一部分孕鼠腹腔注射600 mg/kg 的VPA，余孕鼠注射等體積生理鹽水。子鼠出生后母乳喂養(yǎng)至生后21 d 斷乳，區(qū)分性別，選用雄性子鼠用于實驗。在20只給予VPA 雌鼠所產(chǎn)子鼠中選擇10只進(jìn)行高壓氧治療(高壓氧組):大鼠在高壓氧倉中分別吸純氧60 min，壓力為300 kPa，1次/d，連續(xù)治療15 d，余10只為模型組。另取腹腔注射等量生理鹽水的孕鼠所產(chǎn)的子代雄鼠10只為正常對照。

1．3 生長發(fā)育和行為學(xué)評價 對所有實驗子鼠觀察以下指標(biāo)。

生長發(fā)育監(jiān)測:于生后第7、12、21、35、70天稱量子鼠體重。

運動活性監(jiān)測:①于出生后第67天用曠場實驗［6］的方法檢測大鼠的自發(fā)運動，記錄每只鼠的水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)、中央格穿過率及中央格時間百分比、糞便粒數(shù)。②于生后第69天，根據(jù)文獻(xiàn)［7］的標(biāo)準(zhǔn)，檢測重復(fù)刻板行為。

社會行為監(jiān)測:①出生第35天大鼠社會行為的檢測。實驗前所有大鼠經(jīng)3．5 h 隔離。實驗開始時，將同一組內(nèi)的2只大鼠放入測試籠內(nèi)15 min 進(jìn)行成對測試。記錄大鼠鉗住另一只大鼠的潛伏期和鉗住次數(shù)。②出生第75天大鼠社會行為的檢測。于實驗前1 周將被檢測鼠單籠隔離飼養(yǎng)。實驗當(dāng)日，每只被檢測鼠和一只刺激鼠共同置于檢測籠內(nèi)10 min，測定社會行為出現(xiàn)的潛伏期和次數(shù)(成年鼠的社會行為包括舔或嗅刺激鼠的身體，追逐刺激鼠或趴或爬到刺激鼠身上)。

學(xué)習(xí)記憶測試:于大鼠出生第80天，將檢測鼠背對著程控避暗箱洞口放入明箱之中，并啟動秒表，記錄大鼠從明箱進(jìn)入暗箱的潛伏期，訓(xùn)練5 min，記錄這期間進(jìn)入暗箱的次數(shù)，24 h 后重復(fù)上述操作，記錄進(jìn)入暗箱的時間及被電次數(shù)，此次結(jié)果記入實驗結(jié)果中。

1．4 血漿IL-1β、IL-6 和IL-10 水平的測定 行為學(xué)評分結(jié)束后，各組取5只大鼠用鑷子摘下眼球，采集靜脈血約5 mL，4℃、2 000 r/min 離心20 min，留取血漿，采用ELISA 法測定血漿IL-1β、IL-6 和IL-10水平，具體實驗步驟按試劑盒說明書操作。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 19．0 處理數(shù)據(jù)。采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較3組大鼠出生不同時間體重、社會行為出現(xiàn)次數(shù)及潛伏期的差異;采用單因素方差分析比較3組大鼠部分自發(fā)運動指標(biāo)的差異，兩兩比較采用SNK-q 檢驗;采用秩和檢驗比較3組大鼠糞便粒數(shù)、刻板行為評分及大鼠血漿IL-1β、IL-6 和IL-10 水平的差異。檢驗水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 3組大鼠生長發(fā)育及行為學(xué)評價結(jié)果

2．1．1 生長發(fā)育監(jiān)測結(jié)果 見表1。與正常對照組比較，模型組大鼠發(fā)育遲緩，表現(xiàn)為體重偏低，經(jīng)高壓氧治療后，小鼠體重升高。

表1 出生不同時間3組大鼠體重比較 g

2．1．2 運動活性監(jiān)測結(jié)果 見表2～5。模型組大鼠較正常對照組表現(xiàn)出重復(fù)刻板行為及社會接觸的減少，而經(jīng)高壓氧治療后上述行為有所改善。

表2 3組大鼠自發(fā)運動監(jiān)測指標(biāo)比較

表3 出生第35天和第75天3組大鼠社會行為出現(xiàn)次數(shù)及潛伏期比較

表4 3組大鼠刻板行為比較

表5 3組大鼠被電次數(shù)和避暗潛伏期比較

2．2 3組大鼠血漿細(xì)胞因子水平 模型組血漿IL-1β、IL-6 和IL-10 水平最高，高壓氧組次之，正常對照組最低。見表6。

表6 3組大鼠血漿IL-1β、IL-6 和IL-10 水平比較ng/L

3 討論

大鼠的胚胎11 d 左右神經(jīng)管開始閉合，12 d 左右腦運動神經(jīng)元和核團(tuán)開始形成［8］。如果胚胎在此期間受到外界不利因素的影響，如VPA 等就會影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。VPA 孤獨癥動物模型是孤獨癥的經(jīng)典模型。在受孕12．5 d 的母鼠腹腔注射VPA，其后代子鼠的異常行為表現(xiàn)與孤獨癥患兒相似，比如:社交及探索行為減少、重復(fù)刻板行為、焦慮緊張狀態(tài)等［5-7］。該實驗中作者建立了VPA 孤獨癥大鼠模型，并進(jìn)行生長和發(fā)育、行為學(xué)等相關(guān)監(jiān)測，結(jié)果顯示孤獨癥模型大鼠生長發(fā)育遲緩、重復(fù)刻板行為、社會行為減少，接近人類孤獨癥的行為表現(xiàn)，表明造模成功。

環(huán)境因素在孤獨癥的成因中具有重要作用，多種多樣的環(huán)境因素可能通過宿主炎癥反應(yīng)作用于胚胎神經(jīng)發(fā)育決定性的窗口期。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有生物學(xué)效應(yīng)的小分子物質(zhì)。細(xì)胞因子及其受體在正常神經(jīng)的分化和可塑性以及行為編程中具有重要作用，但異常的細(xì)胞因子水平則可引起機(jī)體認(rèn)知受損、學(xué)習(xí)能力差、異常焦慮、刻板行為、社會交往減少等孤獨癥樣行為。在發(fā)育過程中，細(xì)胞因子和趨化因子在大腦中處于極低的水平，升高的細(xì)胞因子被證實可對腦組織的正常發(fā)育產(chǎn)生不利影響［9-11］，如:IL-6 水平升高被證實可增加興奮性突觸，減少抑制性突觸，增加樹突的長度和促進(jìn)蘑菇狀樹突的形成，并可減少海馬處興奮后抑制，進(jìn)而影響神經(jīng)環(huán)路的平衡和突觸的可塑性;IL-1β 在少突膠質(zhì)細(xì)胞的毒性、神經(jīng)軸突生長和在海馬穩(wěn)態(tài)突觸可塑性的調(diào)節(jié)上具有重要作用;IL-10 可抑制促炎因子的合成并抑制炎性細(xì)胞的活化、聚集，使活化T 細(xì)胞凋亡，抑制淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能，對抗腦組織內(nèi)的過度炎癥性反應(yīng)，減輕炎癥反應(yīng)對腦組織的損傷，保護(hù)腦組織。該研究結(jié)果顯示模型組大鼠血漿中上述3 因子的水平升高，與上述研究結(jié)果相符。于方等［8］對缺血缺氧性腦病患兒的研究發(fā)現(xiàn)高壓氧治療組患兒血漿及腦脊液中IL-6、TNF-α 與常規(guī)治療組相比明顯降低。王國忠等［12］對減壓病小鼠行高壓氧治療后發(fā)現(xiàn)腦組織IL-1β 含量降低，而IL-10 含量無明顯改變。包長順等［13］研究證實高壓氧治療后不僅降低了促炎性細(xì)胞因子，也降低了抗炎性細(xì)胞因子如IL-10。該研究結(jié)果顯示，高壓氧治療后，孤獨癥模型鼠生長發(fā)育遲緩、重復(fù)刻板行為及社會活動減少均有改善，同時血漿IL-1β、IL-6 和IL-10 水平降低，基本與上述研究一致。

綜上所述，孤獨癥的發(fā)病可能與細(xì)胞因子的表達(dá)水平異常有關(guān)，高壓氧干預(yù)治療可降低IL-1β、IL-6、IL-10 水平，從而改善孤獨癥大鼠的生長發(fā)育及社會行為。

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