人水通道蛋白4胞外區的原核表達及純化*

張迎娜，高 峰，方 華，趙 雪，張 婧，杜 英，潘衛東#

1)鄭州大學基礎醫學院微生物學與免疫學教研室 鄭州450001 2)河南省醫藥科學研究院神經免疫學研究室 鄭州450052 3)鄭州市神經免疫學重點實驗室 鄭州450052

視神經脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一種免疫介導的特發性中樞神經系統炎性脫髓鞘疾病，主要損傷視神經和脊髓［1］。2004年Lennon 等［2］使用間接免疫熒光方法(IIF)在NMO 患者的血清中發現了一種能與小鼠小腦、中腦組織選擇性結合的自身抗體，稱為NMO-IgG。2005年Lennon 等［3］用免疫雙標法進一步證實與NMO-IgG 特異性結合的靶抗原為水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)，并將其抗體稱為抗AQP4 抗體。2006年修訂的Wingerchuk 標準［4］將AQP4 抗體陽性作為NMO 的診斷標準之一。AQP4 是六次跨膜蛋白，C 端和N 端均在胞內，含有3個胞外環(A、C、E 環)和兩個胞內環(B、D 環)，胞外環為AQP4 抗體結合的特異性位點［5-7］，因此表達AQP4 的胞外區蛋白有望為NMO 的體外診斷提供原料。該研究利用基因工程手段構建了表達pET32a(+)-AQP4 胞外區的融合蛋白，并進行了純化，以期為進一步研究AQP4 胞外區在診斷NMO 方面的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 菌株及質粒 質粒pUC18 購自寶生物工程(大連)有限公司，質粒pET32a(+)購自Novagen 公司，大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)均由鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室饋贈。

1．2 主要試劑 限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA 連接酶、DNA marker、凝膠回收試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司，質粒小量提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，蛋白Marker、咪唑和氨芐青霉素鈉均購自Genview 公司，IPTG 購自Solarbio 公司，鼠抗組氨酸單克隆抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司，HRP 標記的羊抗鼠IgG 購自北京中杉金橋生物技術有限公司，ECL 發光液購自碧云天生物技術公司，Ni-NTA 親和層析柱由作者自行裝柱。

1．3 基因的設計及合成 根據GenBank 中登錄的AQP4 基因序列(NP_001641．1)，利 用TMHMM Server V2．0 生物軟件在線分析AQP4 蛋白質結構，通過Blast 比對出AQP4 胞外區的基因序列，根據后續實驗的需要及大腸埃希菌“密碼子偏嗜性”設計并合成6 條寡核苷酸單鏈，由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列見表1(僅列3 條)。

1．4 目的基因的克隆及鑒定 將合成的互補寡核苷酸單鏈先用滅菌雙蒸水溶解，在PCR 儀上95℃變性5 min 后自然冷卻至室溫，形成雙鏈DNA。用BamHⅠ、Hind Ⅲ分別雙酶切雙鏈DNA 和pUC18 質粒，回收AQP4 胞外區基因片段和pUC18 質粒片段，按目的基因與載體按物質的量比為3∶1 的比例，用T4 DNA 連接酶16℃連接18 h。連接產物用熱激法轉化感受態大腸桿菌DH5α，同時以空質粒和滅菌雙蒸水進行轉化作為對照，涂布于含有IPTG、X-gal、50 mg/L 氨芐青霉素的LB 固體培養基上，37℃恒溫箱培養16～18 h，挑取白色陽性單個菌落，于37℃200 r/min 搖床上搖菌過夜，用質粒小量提取試劑盒提取重組質粒進行雙酶切鑒定，同時將重組質粒送上海生工生物工程股份有限公司進行測序，并進行序列比對分析。

表1 寡核苷酸單鏈序列*

1．5 重組表達質粒的構建 用BamHⅠ、Hind Ⅲ分別雙酶切重組克隆質粒pUC18-AQP4 胞外區和表達載體pET32a(+)，切膠回收目的基因片段和載體片段，目的基因與載體按物質的量比為3∶1 的比例在T4 DNA 連接酶的作用下于16℃連接18 h。連接產物采用熱激法轉化感受態DH5α，涂布于含有50 mg/L 氨芐青霉素的LB 固體培養基上，37℃培養16～18 h。挑取單個陽性菌落進行鑒定，方法同1．4。

1．6 目的基因的誘導表達 將測序正確的重組表達質粒采用熱激法轉化大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)，涂布于含有50 mg/L 氨芐青霉素的LB 固體培養基上，37℃培養16～18 h。挑取單個菌落接種于25 mL 含有50 mg/L 氨芐青霉素的LB 液體培養基中，37℃培養過夜，次日取菌懸液1 mL 加入到100 mL 新鮮的LB 培養基中，37℃200 r/min 振蕩培養至D600nm為0．4～0．6 時，加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，30℃誘導8 h，收集菌液，12 000 r/min 4℃離心20 min，收集菌體，用PBS 緩沖液重懸，冰浴超聲破碎(超聲10 s，間歇5 s)，12 000 r/min 4℃離心20 min，收集上清液后進行150 g/L SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白的表達情況。

1．7 重組蛋白的純化 收集上述超聲破菌后的上清液，以NTA 層析介質進行純化，層析柱用Bio-Rad的1 mL 重力空柱，用Ni-NTA 填料自行裝柱。第一步為柱平衡，用0．01 mol/L、pH 8．0 的PBS 緩沖液進行柱平衡;第二步為上樣，將離心所得上清液進行上樣，使其液體與柱子進行吸附15 min;第三步為柱平衡，用含20 mmol/L 咪唑的0．01 mol/L、pH 8．0的PBS 緩沖液進行柱平衡，除去未結合的雜蛋白或結合不牢的蛋白;第四步為洗脫，通過100、300 mmol/L 咪唑進行梯度洗脫，并分管收集樣品。

1．8 重組蛋白的Western blot 鑒定 表達的重組蛋白經150 g/L 的SDS-PAGE 電泳分離后，利用濕轉的方法轉移至硝酸纖維素膜上，30 g/L 的BSA 封閉液封閉2 h，加入一抗(鼠抗組氨酸單克隆抗體，按1∶2 000 稀釋)，4℃冰箱孵育過夜，次日搖床上用TBST 緩沖液洗滌3次，10 min/次;再加入酶標二抗(HRP 標記的羊抗鼠IgG，按1∶10 000 稀釋)，搖床上室溫孵育2 h，用TBST 洗滌3次，10 min/次，暗室中ECL 曝光1 min 后進行顯影和定影。

2 結果

2．1 AQP4 3個胞外區形成雙鏈DNA 后的鑒定AQP4 胞外區寡核苷酸單鏈經變性退火后行20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約100 bp 的特異性條帶，見圖1。

圖1 AQP4 胞外區雙鏈DNA 電泳圖

2．2 AQP4 3個胞外區克隆質粒的鑒定 重組克隆質粒的雙酶切產物經20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，可見約100 bp 的目的條帶，與預期大小一致，見圖2。測序結果與AQP4 胞外區基因完全一致。

2．3 AQP4 3個胞外區表達質粒的鑒定 重組表達質粒的雙酶切產物經20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，可見約100 bp 的目的條帶，與預期大小一致，見圖3。測序結果與AQP4 胞外區基因完全相符。

2．4 表達產物的鑒定 表達的重組蛋白經150 g/L的SDS-PAGE 電泳分離后，在相對分子質量約為26 000處可見特異性蛋白條帶，大小與預期相符，見圖4。

圖2 質粒pUC18-AQP4 胞外區的雙酶切鑒定

圖3 質粒pET32a(+)-AQP4 胞外區的雙酶切鑒定

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE 分析

2．5 純化產物的鑒定

圖5 純化的AQP4 SDS-PAGE 分析

2．5．1 SDS-PAGE 分析 純化的蛋白經150 g/L 的SDS-PAGE 電泳分離后，在相對分子質量約26 000處可見特異性蛋白條帶，純度約為75%，見圖5。

2．5．2 Western blot 分析 見圖6。檢測結果顯示，表達純化的融合蛋白pET32a(+)-AQP4 胞外區均可與鼠抗組氨酸單克隆抗體特異性結合，在相對分子質量約為26 000 處可見明顯特異性條帶。然而用AQP4 抗體陽性的血清作為一抗進行Western blot，發現胞外區蛋白未被血清中的AQP4 抗體特異性識別。

圖6 表達產物的Western blot 分析

3 討論

AQP4 是水通道蛋白家族的成員，也是中樞神經系統重要的水通道蛋白，在哺乳動物腦內有大量的表達，主要表達于室管膜細胞和星形膠質細胞的軸突、足突上，參與腦內水平衡調節，因此，AQP4 與腦水腫的相關報道也是層出不窮［8-10］。然而自AQP4 被確定為區別多發性硬化與NMO 的特異性抗體的靶抗原以來，對AQP4 在作為體外檢測NMOIgG 抗體原料應用方面的研究也陸續地被報道:如以組織為底物的IIF［2］，以細胞為底物的IIF［11-12］、放射免疫沉淀法［13］、熒光免疫沉淀法［14］、酶聯免疫吸附試驗［15］、流式細胞術［16］及Western blot［17］，但靈敏度或特異度低、操作繁瑣、費用昂貴等原因限制了其在國內大規模的推廣和應用，因此建立一種適合國人NMO 的檢測方法非常必要。

原核表達系統遺傳背景清楚、培養方法比較簡單、經濟、蛋白表達量高、易于大規模工藝化生產，且技術已相當成熟，因此成為目前應用最廣泛的蛋白質表達系統之一。但由于缺乏合適的翻譯后加工機制，表達的產物不能進行翻譯后修飾，從而不能有效地折疊形成復雜的空間結構，且利用大腸桿菌表達外源蛋白時很難獲得大量的可溶性蛋白，而蛋白的可溶性是保證蛋白生物活性的先決條件。Trx A 是大腸桿菌的自身蛋白，具有熱穩定性及氧化還原作用，作為融合標簽可以促進蛋白的可溶性表達，并能輔助蛋白二硫鍵的形成及正確折疊。通常情況下在大腸桿菌中以包涵體形式表達的蛋白通過與Trx A標簽融合表達，均可以獲得可溶性的表達蛋白［18-19］。該研究通過Trx A 與AQP4 胞外區的融合表達成功獲得了可溶性表達的AQP4 胞外區，且在pET32a(+)載體中存在6個組氨酸標簽，利用Ni2+親和層析柱具有吸附6個組氨酸標簽的高度特異性，通過一步親和層析也可達到較高的純度。

該研究表達的AQP4 3個胞外融合蛋白通過ExPASy 軟件在線預測其相對分子質量約為23 000，然而在經SDS-PAGE 電泳分離后發現融合蛋白的相對分子質量均在26 000 左右，這可能是組氨酸標簽的原因［20］:因為組氨酸是堿性氨基酸，且是帶正電荷的，而載體中的組氨酸標簽中含有6個連續組氨酸，帶有大量的正電荷，降低了蛋白在SDS-PAGE 中遷移的速度，導致了蛋白質表觀相對分子質量與實際相對分子質量存在一定的偏差。

利用表達的AQP4 胞外區蛋白與篩選的AQP4抗體陽性血清進行Western blot，發現表達蛋白未被抗體特異性識別，作者推測其中的原因可能是僅表達胞外區不能形成三維空間結構，而抗體識別的是蛋白的三維空間結構，但這一推測有待進一步驗證。

總之，該研究完成了AQP4 胞外區與Trx A 的可溶性融合表達，為后續進行AQP4 胞外區的生物活性研究奠定了基礎。

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