非重型再生障礙性貧血患兒端粒長度及端粒酶活性與免疫抑制治療的關系

付 亮，張雁儒，王西閣#，王 璇

1)鄭州大學第三附屬醫院兒內科 鄭州450052 2)鄭州大學基礎醫學院人體解剖學教研室 鄭州450001

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是兒童時期常見的血液系統疾病，其發病機制尚未完全闡明。隨著研究的深入，端粒及端粒酶與AA 的關系引起國內外學者的關注。有研究［1］顯示:成人AA存在端粒長度縮短及端粒酶活性降低的現象，這部分患者對免疫抑制治療反應差。與成人AA 不同，兒童患者尤其是非重型再生障礙性貧血(non-severe aplastic anemia，NSAA)患兒骨髓增生程度以活躍及明顯活躍為多見。作者分析了NSAA 患兒端粒長度及端粒酶活性與免疫抑制治療反應及預后的關系，現將結果報道如下。

1 臨床資料

1．1 一般資料 NSAA組為2010年1月至2015年1月鄭州大學第一附屬醫院及第三附屬醫院初次確診為NSAA 的患兒102例，男57例，女45例，中位年齡10(4～16)歲，診斷標準參考《兒童獲得性再生障礙性貧血診療建議》［2］，確診后未治療時留取外周血6 mL，EDTA 抗凝。選擇同期進行體檢的年齡及性別構成匹配的健康兒童45例作為正常對照組，男24例，女21例，中位年齡9(3～15)歲，取外周靜脈血6 mL，EDTA抗凝。該研究征得研究對象家屬知情同意。

1．2 治療方案及療效判定標準 該研究中治療方案為環孢素A(CsA)聯合司坦唑醇:CsA 3～5 mg·kg－1·d－1，分2次口服;司坦唑醇0．1～0．3 mg·kg－1·d－1，分2次口服。治療期間監測血常規、肝腎功能、網織紅細胞等，合并感染、嚴重貧血或出血者酌情應用抗生素、輸注紅細胞或血小板?；純航邮苤委熀?個月評估療效，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、未緩解(NR)［2］。

1．3 主要試劑及儀器 細胞/細菌/酵母基因組DNA 提取試劑盒購自上海萊楓生物科技有限公司;SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒購自大連TaKaRa 有限公司;TRAP－PCR 試劑盒購自南京凱基生物有限公司，Trizol 試劑購自Invitrogen 公司，單個核細胞分離液及造血干細胞分離液購自天津灝洋試劑公司;引物由上海Invitrogen 生物技術有限公司設計、合成;TE Buffer(pH =8．0)、異丙醇、乙醇均為市售分析純。實時熒光定量PCR 儀為ABI Prism?7500 型。

1．4 外周血單個核細胞DNA 提取及端粒長度檢測 取EDTA 抗凝血3 mL，用單個核細胞分離液分離外周血單個核細胞，按照試劑盒步驟提取基因組DNA，測定DNA 濃度及純度，用TE Buffer 將樣品DNA 調整至10 mg/L，所有DNA 樣本放入－20℃冰箱保存待測。利用RT－PCR 分別檢測樣品端粒及內參36B4 基因PCR 擴增的Ct 值。每次反應均設標準曲線，每個樣品設3個復孔。引物序列:端粒上游引物5'－CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTT GGGTTTGGGTT－3' ，下游引物5'－GGCTTGCCTTAC CCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT－3';36B4 基因上游引物5'－CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC－3'，下游引物5'－CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA－3'。反應體系均為20 μL:2 × SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，ROX Reference Dye 0．4 μL，樣品DNA(10 mg/L)3 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0．4 μL，用去離子水調整終體積為20 μL。反應條件:95℃30 s;95℃5 s，60℃30 s，40個循環。采用2－ΔΔCt法計算端粒相對長度。

1．5 外周血造血干細胞分離及端粒酶活性檢測取EDTA 抗凝血3 mL，用造血干細胞分離液分離外周血造血干細胞，按照試劑盒說明提取端粒酶，Bradford 法測定端粒酶濃度，用Lysis Buffer 將樣品調整至1 g/L，－20℃保存待測。利用TRAP－PCR銀染法測定端粒酶活性，TRAP 反應體系共50 μL:5 μL 10 ×TRAP Buffer，1 μL dNTPs，1 μL Taq－DNA 聚合酶，1 μL TS Primer，2 μL 端粒酶提取物，用DEPC水調整終體積為50 μL;23℃保溫30 min 后加入1 μL CX Primer，混勻，于PCR 擴增儀上進行擴增。反應條件:94℃5 min;94℃30 s，50℃30 s，72℃90 s，30個循環;72℃延伸10 min。用硝酸銀對TRAP產物聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果進行染色，采用Multi Anslust 軟件計算端粒酶活性。

1．6 統計學處理 采用SPSS 17．0 進行統計學分析。NSAA組與正常對照組端粒相對長度及端粒酶活性的比較采用兩獨立樣本的t 檢驗;不同療效組端粒相對長度及端粒酶活性的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD－t 檢驗。檢驗水準α=0．05。

1．7 結果 NSAA組端粒相對長度小于正常對照組，端粒酶活性高于正常對照組，見表1。NR組及PR組端粒相對長度小于CR組，且NR組端粒相對長度小于PR組;CR組及PR組端粒酶活性高于NR組，但CR組與PR組端粒酶活性相比，差異無統計學意義，見表2。

表1 正常對照組和NSAA組端粒相對長度及端粒酶活性比較

表2 不同療效組NSAA患兒端粒相對長度及端粒酶活性比較

2 討論

AA 是一種全血細胞減少的骨髓衰竭性疾病，其發病機制尚不明確，大部分AA 患者應用免疫抑制劑療效顯著，因此認為AA 的發病與免疫機制有關［3］，但仍有一部分患者經過免疫抑制治療無效或復發。端粒是真核生物染色體末端一段高度保守的結構，其作用是保護染色體DNA 完整性。端粒長度隨年齡的增長逐漸縮短，其長度的維持需要端粒酶合成端粒DNA 并添加到染色體末端［4－5］。

早在20 世紀末，Ball 等［6］研究發現AA 患者外周血白細胞端粒DNA 長度較年齡調整后的正常人群縮短。而在對于兒童AA 的研究［7］中發現，AA 患兒造血干細胞端粒酶活性較對照組升高，且慢性AA組較急性組升高尤為明顯。該研究中NSAA組患兒初診時端粒長度較正常對照組縮短，而端粒酶活性升高，與既往研究結果一致。分析其原因如下，兒童造血干細胞自我更新能力及增生潛能較高，造血功能代償能力強，因而骨髓增生程度較為活躍。AA 患者由于各種因素導致機體免疫功能紊亂，免疫細胞異?；罨?，通過細胞因子作用殺傷骨髓干/祖細胞并抑制其分化，剩余造血干細胞因代償造血而大量分裂使細胞端粒縮短［8］。正常人端粒酶活性維持在低水平狀態［9］，而在AA 患者中，機體通過負反饋作用上調端粒酶活性，延長端粒使之恢復正常水平。由于慢性AA 進展時間長，更多的干細胞可以進入細胞周期，充分進行代償，因而端粒酶活性升高，端粒損耗不明顯。

該研究中作者發現，CR組及PR組AA 患兒初診時端粒酶活性明顯升高。分析其原因可能與端粒酶自身的特點有關，正常情況下造血干細胞端粒酶活性較低，當端粒長度足夠長時，端粒酶活性并非必需的，而當端粒的長度縮短到一定程度時，端粒酶活性高低成為維持端粒長度的關鍵因素。CR組端粒酶活性升高可以充分代償端粒長度的縮短，使之恢復正常水平，這部分患兒造血干細胞可以恢復正常造血潛能，因而臨床治療效果好。PR組患兒同樣表現出端粒酶活性升高，但端粒相對長度小于CR組，而較NR組高。推測這部分患兒雖表現出一定的負反饋調節機制，在一定程度上可以延長損耗的端粒，但代償相對不足，這也可以解釋為什么大部分NSAA 患兒經免疫抑制治療后可以長期生存，另一部分患兒則出現不同的轉歸。而NR組端粒相對長度較CR組及PR組明顯縮短，其端粒酶活性水平較低。提示造血細胞過度分裂，端粒酶活性不足以代償端粒損耗，導致造血功能衰竭，臨床表現為治療效果不佳［10－13］。

目前對于高表達端粒酶活性的白血病等增殖性疾病，通過靶向治療抑制其端粒酶活性可取得理想的療效。據此在NSAA 患兒中，尤其是存在端粒長度縮短或端粒酶活性下降的患兒，可通過靶向性激活端粒酶的活性延長端粒長度，從而改善預后，這為NSAA 的治療提供了新的思路。

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