臭氧急性暴露對(duì)豚鼠肺組織中NO水平的影響*

段麗菊，隋美麗，趙凝秋，李思晨，王如群，胡 婕，陳彬翰

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州450001 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州450001

△女，1981年11月生，博士研究生，講師，研究方向:環(huán)境毒理學(xué)，E－mail:dlj@zzu．edu．cn

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，空氣污染物數(shù)量急劇增加。汽車尾氣中的氮氧化物和揮發(fā)性有機(jī)物在紫外線的照射下發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生大量的臭氧，導(dǎo)致大氣中臭氧污染極為嚴(yán)重。目前，我國(guó)很多大中城市如北京、上海、青島、鄭州等均存在大氣臭氧含量超標(biāo)的現(xiàn)象［1－4］。臭氧具有強(qiáng)氧化性，能強(qiáng)烈刺激呼吸道，造成咽喉腫痛、胸悶咳嗽，引發(fā)支氣管炎和肺氣腫。吸入臭氧會(huì)導(dǎo)致肺部上皮層的蛋白質(zhì)和酯類物質(zhì)發(fā)生氧化作用，生成氧化蛋白和自由基，損傷上皮組織，導(dǎo)致肺部巨噬細(xì)胞數(shù)量增多并產(chǎn)生細(xì)胞毒素、炎癥介質(zhì)［5－6］。臭氧的強(qiáng)氧化性導(dǎo)致肺組織產(chǎn)生的活性氧和活性氮等會(huì)繼續(xù)對(duì)組織造成傷害，嚴(yán)重危害人體的健康［7］。一氧化氮(nitric oxide，NO)在許多病理反應(yīng)中具有介導(dǎo)炎癥細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方向的功能，是一種很活躍的自由基。在炎癥反應(yīng)過程中，NO 可由多種相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK 細(xì)胞等。適量的NO 對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用，但過量的NO 具有細(xì)胞毒性作用，可損傷肺泡上皮細(xì)胞表面磷脂及蛋白，抑制肺泡表面活性物質(zhì)的生成，促進(jìn)肺組織的炎性滲出及肺泡的損傷［8］。作者采用體積分?jǐn)?shù)為0．000 1%的臭氧對(duì)豚鼠染毒3 h，測(cè)定豚鼠肺組織中NO 含量及一氧化氮合酶(NOS)活力，從而研究臭氧暴露對(duì)機(jī)體肺組織NO 含量的影響，以進(jìn)一步探討臭氧所致呼吸道炎癥反應(yīng)可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只3個(gè)月齡Dunkin Hartley 豚鼠，普通級(jí)，雌雄各半，體重280～350 g，購(gòu)自北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司，合格證號(hào)為SCXK(京)2010－0001。飼養(yǎng)于20～25℃、相對(duì)濕度為40%～70%的環(huán)境中。每天供給自來水、豚鼠飼料及新鮮蔬菜，動(dòng)物飲食自由。

1．2 儀器及試劑 HOPE－MED 8050 動(dòng)態(tài)染毒系統(tǒng)(天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司)，HH－42 數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱(常州國(guó)華電器有限公司)，H1650－W離心機(jī)(湖南象儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，XH－C混合器(常州朗越儀器制造有限公司)，V－5800PC型可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)，Z－1200 型臭氧檢測(cè)儀(美國(guó)ESC 公司)，CH－KTB2G 臭氧發(fā)生儀(廣州創(chuàng)環(huán)臭氧電器設(shè)備有限公司)，玻璃勻漿器和恒溫箱。NO 測(cè)定試劑盒、NOS 測(cè)定試劑盒、BCA 法蛋白定量測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，戊巴比妥鈉鹽購(gòu)自德國(guó)Merck 公司。

1．3 分組與染毒 雌、雄豚鼠均隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、臭氧暴露組，每組各10只。暴露前，采用臭氧發(fā)生儀，通過調(diào)節(jié)參數(shù)，使之能夠穩(wěn)定地輸出染毒所需濃度的臭氧。將臭氧測(cè)定儀置于染毒柜中，監(jiān)測(cè)臭氧濃度。待臭氧濃度穩(wěn)定在體積分?jǐn)?shù)為0．000 1%左右10 min 時(shí)將臭氧暴露組豚鼠置于染毒柜中暴露3 h(國(guó)際上公認(rèn)的臭氧急性染毒模型濃度);暴露期間，每5 min 記錄一次臭氧濃度。陰性對(duì)照組置于通入過濾空氣的染毒柜中，臭氧濃度為0，暴露3 h。

1．4 肺組織中NO 含量及NOS 活力的測(cè)定 豚鼠于當(dāng)日上午8:00 開始連續(xù)染毒3 h，次日上午8:00麻醉處死，取肺組織迅速置于冰上制成勻漿，3 000 r/min 離心10 min。取組織勻漿上清液，按各試劑盒操作說明書進(jìn)行NO 含量、NOS 活力測(cè)定。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21．0 進(jìn)行分析。分別應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)分析兩組大鼠肺組織中NO 含量和NOS 活力［應(yīng)用M(P25，P75)進(jìn)行描述］的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 臭氧染毒濃度的測(cè)定結(jié)果 臭氧急性暴露3 h過程中，豚鼠實(shí)際暴露劑量為0．000 101% ±0．000 005%，與設(shè)定的體積分?jǐn)?shù)為0．000 1%非常吻合，變異系數(shù)僅為4．95%，說明用動(dòng)態(tài)染毒系統(tǒng)和臭氧發(fā)生儀建立的動(dòng)態(tài)臭氧染毒系統(tǒng)是可靠的。

2．2 豚鼠肺組織中NO 含量和NOS 活力測(cè)定結(jié)果見表1。1 ppm 臭氧急性暴露3 h 可使豚鼠肺組織中NO 含量升高，但對(duì)肺組織NOS 活力無影響。

表1 豚鼠肺組織中NO 含量和NOS 活力測(cè)定結(jié)果

3 討論

臭氧作為光化學(xué)煙霧的產(chǎn)物之一，是一種普遍存在的城市空氣污染物。以往關(guān)于臭氧急性暴露的研究中，大多采用體積分?jǐn)?shù)為0．000 1%臭氧連續(xù)暴露3 h 的急性暴露模型［9］。相關(guān)研究［9－11］表明，臭氧急性暴露可導(dǎo)致肺部發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，引起氣道高反應(yīng)性，降低肺功能。

作者的研究結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)為0．000 1%臭氧暴露3 h 可導(dǎo)致豚鼠肺組織中NO 含量升高，說明臭氧暴露可導(dǎo)致肺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，該研究結(jié)果與張景明等［12］的研究結(jié)果一致。Modig 等［13］隨機(jī)選取瑞士5 841 位25～75歲成年人進(jìn)行研究，通過測(cè)定其呼出氣中NO 含量，發(fā)現(xiàn)人群短期臭氧暴露可導(dǎo)致呼出氣中NO 含量增加。Khan 等［14］在研究人體內(nèi)源性異戊二烯在炎癥反應(yīng)時(shí)的生理功能時(shí)發(fā)現(xiàn)呼出氣中NO 含量與所暴露臭氧濃度呈正相關(guān)。但Barath 等［15］通過將健康志愿者分別暴露于顆粒物濃度為300 μg/m3的汽車柴油尾氣及過濾空氣中1 h 和體積分?jǐn)?shù)為0．000 03%臭氧及過濾空氣中75 min 進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)呼出氣中NO 含量增高與臭氧無關(guān)，而是與柴油尾氣相關(guān)，提示兩者所致的呼吸道炎癥反應(yīng)機(jī)制不同，而臭氧所致的急性呼吸道炎癥反應(yīng)不能用呼出氣中NO 含量來檢測(cè)，該研究與以往研究［16－17］結(jié)果一致。

肺組織中NO 含量增高的原因可能是NO 合成增加，或代謝減少。機(jī)體內(nèi)NO 合成主要有兩種途徑:①通過NOS 介導(dǎo)合成。②通過亞硝酸鹽還原產(chǎn)生。而體內(nèi)NO 代謝主要有3種途徑:①在有氧條件下，被快速氧化。②與各種分子相互反應(yīng)，如NO與超氧陰離子反應(yīng)產(chǎn)生具有很強(qiáng)細(xì)胞毒性的過氧亞硝基。③NO 及其衍生物修飾蛋白質(zhì)半胱氨酸自由巰基，生成亞硝基巰醇。作者的研究結(jié)果顯示，體積分?jǐn)?shù)為0．000 1%臭氧急性暴露對(duì)豚鼠肺組織中NOS 活力無影響，表明臭氧暴露組NO 含量升高并非通過機(jī)體內(nèi)NOS 介導(dǎo)合成增加所致，很可能是臭氧暴露導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)亞硝酸鹽還原增加或NO 代謝途徑受阻所致。具體原因有待更深層次的研究。

NO 作為一種可調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的信息分子，具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的功能，可作為臭氧所致氣道炎癥反應(yīng)中的一種介質(zhì)。同時(shí)，NO 也是某些急性肺損傷的損傷因子，可與超氧自由基結(jié)合生成過氧亞硝酸鹽，導(dǎo)致氣道炎癥和氣道上皮損傷，發(fā)揮其毒性作用［8］。臭氧所致炎癥反應(yīng)過程中會(huì)產(chǎn)生自由基及活性氧、活性氮，而這些物質(zhì)本身即可對(duì)肺組織造成傷害。這表明，臭氧急性暴露在導(dǎo)致豚鼠肺部發(fā)生炎癥反應(yīng)的同時(shí)，肺組織中升高的NO 會(huì)加重臭氧導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，加大其對(duì)肺組織的傷害。

總之，臭氧急性暴露可使豚鼠肺組織中NO 含量升高，但并不影響體內(nèi)NOS 活力。進(jìn)一步探討臭氧急性暴露導(dǎo)致肺組織中NO 含量升高的原因，將有利于研究臭氧所致的肺部炎癥損傷的機(jī)制，并為臭氧所致呼吸系統(tǒng)損傷的預(yù)防與治療提供依據(jù)。

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