擬缺香茶菜提取物體外對3種腫瘤細胞增殖的抑制作用*

陳慧平，馬 方，鄒 敏，李繼成，張 艷，趙志鴻，王桂芳，張壯麗，張小俊

鄭州大學醫藥科學研究院藥化研究室鄭州450052

擬缺香茶菜別名野紫蘇，為唇形科香茶屬植物，在我國分布范圍相當廣泛，可供藥用者達30 余種，是民間廣泛使用的草藥，大都具有清熱解毒、活血化瘀、抗菌消炎及抗腫瘤等功效［1］。香茶菜屬植物含有多種次生代謝產物，其中對映貝殼杉烷型二萜化合物是其最主要的次生代謝物［2］。據報道［3］，該類化合物具有良好的生物活性，如細胞毒活性、抗氧化作用、免疫調節作用及抗菌抗病毒作用。為了更好地開發利用該植物資源，尋找其活性成分，該研究采用MTT 法觀察擬缺香茶菜乙醚和乙酸乙酯提取物對人肝癌細胞株HepG2、人食管癌細胞株EC9706和人乳頭狀甲狀腺癌細胞株TPC-1 增殖的抑制作用，為進一步分離其抗腫瘤活性成分提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 藥材 擬缺香茶菜采自河南龍浴灣，經鄭州大學藥學院李繼成教授鑒定。將采集的擬缺香茶菜地上部分自然陰干，磨碎，裝入塑料袋密封，置于干燥陰涼處備用。

1．1．2 主要試劑 MTT、RPMI 1640 培養基(美國Solarbio 公司)，優質胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，其余試劑均為市售分析純。

1．1．3 主要儀器 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠，型號RE-2000)，CO2培養箱(力康發展有限公司，型號HF160W)，倒置顯微鏡(奧林巴斯，型號BDS200)，EXL800uv 全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司，型號168-1000XC)，生物安全柜(力康發展有限公司，型號HFsafe-1200TE)，精密可調微量移液器(德國Eppendorf 公司)。

1．1．4 細胞 HepG2、EC9706、TPC-1 細胞均由鄭州大學醫藥科學研究院藥化研究室提供。

1．2 藥材的提取、分離 取擬缺香茶菜原藥材1 kg，粉碎機粉碎，用無水乙醚5 000 mL 浸泡21 d(乙醚需淹沒藥材)，用濾紙常溫、常壓下過濾，減壓濃縮得浸膏(乙醚提取物)29 g。將乙醚提取后的殘渣倒入干凈的搪瓷盤，常溫下乙醚揮發完全，直到無乙醚味;把殘渣裝入一5 L 球形燒瓶中，加入3 500 mL乙酸乙酯，浸泡24 h，加熱回流2 h，然后常溫、常壓下過濾，得到約2 800 mL 浸取液，減壓濃縮得浸膏(乙酸乙酯提取物)22 g。

1．3 MTT 法測定不同溶媒提取物對各腫瘤細胞的增殖抑制作用

1．3．1 細胞培養 HepG2、EC9706 和TPC-1 細胞均為貼壁細胞，使用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基在37℃、飽和濕度、體積分數5%CO2培養箱中常規培養;每2～3 d 換液1次，當細胞達90%融合時進行傳代培養。實驗過程中用臺盼藍染色法檢測細胞活性。

1．3．2 提取物的處理 分別準確稱取擬缺香茶菜乙醚提取物和乙酸乙酯提取物，加入二甲基亞砜充分溶解后配成100 g/L 母液，置于－20℃冰箱避光保存。臨用前用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基稀釋成所需濃度。

1．3．3 MTT 檢測方法 收集對數生長期細胞，用細胞計數板計數，調整細胞懸液密度為(7～8)×104mL－1，于96 孔細胞培養板中每孔加入100 μL，每個濃度設3個復孔，體積分數5% CO2、37℃孵育24 h，待細胞貼壁后小心吸去上清，加入含0．80、4．00、20．00、100．00、500．00 mg/L(HepG2 和TPC-1 細胞)或3．12、6．25、12．50、25．00、50．00 mg/L(EC9706 細胞)擬缺香茶菜提取物的培養基100 μL，并設空白對照孔。連續培養48 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液(5 g/L)，繼續培養4 h 后，小心吸去孔內培養基，每孔加入二甲基亞砜150 μL，置搖床上低速避光振蕩6 min，使結晶物充分溶解，酶標儀(檢測波長490 nm，參考波長630 nm)測定，并讀取各孔吸光度(A)值，按下面公式計算腫瘤細胞的增殖抑制率:增殖抑制率=(1 －給藥孔A 值/空白對照孔A 值)×100%，同時計算2種提取物對3種腫瘤細胞的半數有效抑制濃度(IC50)［4］。

1．4 統計學處理 采用SPSS 21．0 進行統計學處理。5組間細胞增殖抑制率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗;2種提取物IC50的比較采用兩獨立樣本的t 檢驗。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 擬缺香茶菜提取物對體外培養的腫瘤細胞增殖的抑制作用 結果見表1、2。

表1 HepG2 和TPC-1 細胞增殖抑制率的比較(n=3) %

2．2 擬缺香茶菜提取物體外抗腫瘤作用的比較 2種提取物對3種腫瘤細胞的IC50見表3。

表2 EC9706 細胞增殖抑制率的比較(n=3) %

3 討論

當前腫瘤的化學預防研究的主要目標之一是尋找高效、低毒的藥物。隨著分子腫瘤學研究的深入，抗腫瘤天然藥物研發過程中體外抗腫瘤實驗已成為必不可少的一部分［5］。MTT 法具有靈敏度高、重復性好、操作簡便、經濟等特點，常用于抗腫瘤藥的體外初篩試驗［6］。

作者選用擬缺香茶菜乙醚提取物和乙酸乙酯提取物進行了體外細胞增殖檢測，結果表明乙醚提取物和乙酸乙酯提取物對HepG2、EC9706 和TPC-1 細胞均有較強的增殖抑制作用。研究［7］表明，使用MTT 法進行抗癌藥物體外篩選時，植物粗提物IC50＜20 mg/L 時，則判斷樣品對體外腫瘤細胞具有強殺傷作用。在該研究中擬缺香茶菜乙醚提取物對EC9706 細胞的IC50為(2．36 ±0．15)mg/L，乙酸乙酯提取物對該細胞的IC50為(4．15 ±0．18)mg/L，提示擬缺香茶菜乙醚提取物和乙酸乙酯提取物對EC9706 細胞均有較強的殺傷作用。

總之，擬缺香茶菜乙醚提取物對HepG2、EC9706 和TPC-1 細胞均有較好的增殖抑制作用，尤其是對EC9706 細胞的增殖抑制作用更強，但其具體活性成分、活性成分抗瘤譜及體內抗腫瘤活性等方面還有待進一步深入研究。

［1］李火云，焦珂，張鵬，等．擬缺香茶菜化學成分研究［J］．中草藥，2014，45(2):154

［2］李恒，普建新，李捷．唇形科香茶菜屬二萜類化合物分布規律［J］．植物分類與資源學報，2013，35(1):81

［3］吳月霞，張偉，李繼成，等．尾葉香茶菜化學成分的研究［J］．中草藥，2011，42(12):2402

［4］趙斌，葛金芳，朱娟娟，等．小議在MTT 法測細胞增殖抑制率中IC50的計算方法［J］．安徽醫藥，2007，11(9):834

［5］周全，陳建偉，劉曉蓉，等．柳樹中生物堿類化合物抗腫瘤活性的體外實驗研究［J］．南京中醫藥大學學報，2012，28(3):238

［6］游文瑋，趙培亮，鄒敏，等．新結構嘧啶類化合物的合成及抗腫瘤活性篩選［J］．南方醫科大學學報，2011，31(5):875

［7］Wu YX，Zhang W，Li JC，et al．Chemical constituents of flowers and fruits of Rabdosia excisa［J］．Chin J Nat Med，2012，10(1):43