膠質瘤相關性癲癇致癇灶組織中高遷移率族蛋白B1的表達*

王新軍，楊如意，周少龍，楊永輝，武躍輝，王 振，謝井偉，梁 博

1)鄭州大學第五附屬醫院神經外科 鄭州450052 2)鄭州大學第三附屬醫院兒童腦癱康復科 鄭州450052

△男，1965年7月生，博士，教授，主任醫師，研究方向:腦腫瘤的基礎與臨床，E-mail:wangxj@zzu．edu．cn

目前，癲癇發病機制尚不明確。成人期癲癇最常見的病因為腦腫瘤，大部分低病理級別膠質瘤伴癲癇發作［1］。膠質瘤并致癇灶切除術是治療膠質瘤相關性癲癇的常用方法，且療效顯著［2-3］。高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box-1，HMGB1)作為一種染色質非組蛋白核蛋白，幾乎存在于所有真核細胞內［4］。已有研究［5-6］證實HMGB1 及其受體TLR4 參與癲癇鼠模型的發病和復發，并且人類顳葉癲癇病例海馬中HMGB1 和TLR4 表達的組織病理學模式與癲癇鼠模型相似;HMGB1 及其受體TLR4、RAGE 通過參與免疫反應促使癲癇的發生。作者對人腦膠質瘤相關性癲癇致癇灶組織中HMGB1 的表達進行了檢測，探討其臨床意義。

1 對象與方法

1．1 研究對象 選取鄭州大學第五附屬醫院神經外科2007年1月1日至2009年12月30日手術治療的82例膠質瘤相關性癲癇患者手術切除的致癇灶組織、膠質瘤組織、瘤周非致癇灶腦組織蠟塊標本。82例患者年齡15～68歲，其中男60例，女22例;術前均有典型癲癇發作癥狀，腦電監測可確認癲癇;24例患者致癇灶位于額葉，40例位于顳葉，18例位于頂葉;術前癲癇發作持續時間≤5 min 40例，＞5 min 42例;術前癲癇平均發作頻率≤3次/月24例，＞3次/月58例;21例為低病理級別膠質瘤，61例為高病理級別膠質瘤;所有患者術前均未接受放化療及其他治療。腫瘤組織均經病理診斷為膠質瘤。術中參考腦皮層和深部電極監測結果取非功能區致癇灶組織標本。瘤周非致癇灶腦組織為術中未引發異常腦電、且術后病理未見膠質瘤細胞的非功能區腦組織。入選標本及臨床信息均已獲患者、家屬及醫院倫理委員會同意。

1．2 主要試劑和儀器 兔抗人HMGB1 單克隆抗體購自美國Sigma 公司，羊抗兔二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒購自上海拜沃生物科技有限公司，熒光顯微鏡購自日本Nikon 公司。

1．3 HMGB1 蛋白的檢測 標本包埋后以3 μm 厚連續切片，置于防脫劑預處理后的載玻片上。滴加HMGB1 單克隆抗體(稀釋20 倍)4℃過夜，PBS 清洗后滴加生物素標記二抗，室溫孵育20 min，PBS 清洗，加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min，DAB 顯色，蘇木精復染，常規乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。以PBS 液代替一抗作陰性對照。選擇每張切片免疫反應較強的區域，高倍視野下(×400)觀察5個不重復視野，計數染色陽性細胞及視野內總細胞數，計算陽性細胞百分比。根據陽性細胞百分比評分:無陽性細胞為0 分，陽性細胞百分比≤25%為1 分，≤50%為2 分，≤75%為3 分，＞75%為4 分;根據染色程度評分:無染色為0 分，淡黃色為1 分，深黃色為2 分。最后以兩種評分方式相加的綜合得分為最終得分，0 分為陰性，1～6 分為陽性;其中1～3 分為低表達，4～6 分為高表達。

1．4 統計學處理 利用SPSS 17．0 進行統計學處理。致癇灶、膠質瘤與瘤周非瘤腦組織中HMGB1表達的比較采用配對χ2檢驗，不同臨床病理因素患者致癇灶組織中HMGB1 表達的比較應用χ2檢驗，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 各種腦組織中HMGB1 的表達 HMGB1 在瘤周非致癇灶腦組織中有少量表達(圖1)，致癇灶組織、膠質瘤組織中HMGB1 的表達明顯高于瘤周非致癇灶腦組織(表1、2)。

圖1 膠質瘤、致癇灶、瘤周非致癇灶腦組織中HMGB1 的表達(SP，×400)

表1 致癇灶、瘤周非致癇灶腦組織中HMGB1 表達的比較例

表2 膠質瘤、瘤周非致癇灶腦組織中HMGB1 表達的比較例

2．2 致癇灶組織中HMGB1 的表達與臨床病理因素的關系 膠質瘤相關性癲癇患者致癇灶組織中HMGB1 表達與性別、年齡、致癇灶位置無關，而與癲癇持續時間、癲癇發作頻率、膠質瘤病理級別有關(表3)。

表3 致癇灶組織中HMGB1的表達與臨床病理因素的關系例(%)

3 討論

目前，對癲癇的發病機制研究較多，國內外研究［5-6］提示HMGB1 在原發性癲癇的發病、復發中均起到重要作用，對于膠質瘤相關性癲癇，國內外鮮見類似報道。膠質瘤相關性癲癇藥物治療效果欠佳，屬難治性癲癇。針對這類患者，鄭州大學第五附屬醫院神經外科通常采用的方法為術中皮層腦電監測準確定位致癇灶，切除膠質瘤的同時，盡可能地切除致癇灶，這樣才能使膠質瘤相關性癲癇的手術效果得以保障［7-8］。這種手術治療的方法是該研究標本獲取的前提。

該研究中，HMGB1 在膠質瘤組織、致癇灶組織中的表達均高于瘤周非致癇灶腦組織，提示HMGB1 不僅參與了膠質瘤的生長、浸潤［9］，對癲癇的發病也起到重要作用。膠質瘤在生長、浸潤過程中HMGB1 高表達，影響瘤周組織的微環境，HMGB1 與其受體共同作用使皮層異常放電、信號傳遞紊亂，這可能是膠質瘤繼發性癲癇的發病機制，HMGB1 及其作用機制可能成為膠質瘤相關性癲癇研究的新方向。

該研究發現，致癇灶組織中HMGB1 的表達與患者的性別、年齡、致癇灶位置無關，而與癲癇持續時間、發作頻率關系密切，該結果進一步表明HMGB1 表達與膠質瘤相關性癲癇的發病有直接關系，換言之，膠質瘤相關性癲癇的發作可能隨致癇灶組織中HMGB1 表達的增高而劇烈。推測HMGB1在致癇灶中高表達將直接影響致癇灶異常放電的強度、頻率，致使癲癇發作頻繁、持續時間延長。接下來的研究中作者將會驗證這種推測，若成立，則HMGB1 將可能成為藥物控制癲癇的新靶點。

研究［10］表明，膠質瘤中HMGB1 表達與其病理級別關系密切。該研究發現膠質瘤相關性癲癇致癇灶組織中HMGB1 的表達與膠質瘤病理級別有關，這與Lynam 等［11］回顧性研究的癲癇發生率與組織學分級呈負相關的結論基本吻合。膠質瘤相關性癲癇常由低病理級別膠質瘤引起，低病理級別膠質瘤中包含分化良好的細胞，其可釋放神經傳導物質，這些傳導物質可參與癲癇的發生;低病理級別膠質瘤生長時間長，其炎癥反應亦可引發癲癇［12］。低病理級別膠質瘤更易引起癲癇發作，并且其致癇灶組織中HMGB1 高表達的可能原因有:①腫瘤性病變中神經元、膠質細胞的酶、蛋白質表達及免疫反應異常影響腦功能，引發癲癇。②腫瘤本身產生并刺激致癇灶產生大量HMGB1，HMGB1 與其受體(如TLR4［5］、RAGE［6］等)形成異常放電通路，形成癲癇發作的基礎。研究［13-14］表明，IL-1β 和HMGB1 參與炎癥反應，降低癲癇發作的閾值，通過干預炎癥反應徑路可減少癲癇發作頻率、降低發作程度和病理損害程度。上述研究結果均提示HMGB1 對癲癇的發生、發作有重要意義。

綜上所述，該研究揭示了致癇灶組織中HMGB1 表達與膠質瘤相關性癲癇臨床病理因素之間的關系，對臨床治療、預后判斷均有一定意義，但膠質瘤、致癇灶組織中HMGB1 促發癲癇的具體機制尚需進一步探討。

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