沉默熱休克蛋白70基因對A549細胞凋亡的影響*

闕菡雅，王小龍，李 杰，徐小艷，夏艷秋，周 舫#

1)鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學教研室 鄭州450001 2)靖邊縣疾病預防控制中心慢性病科 靖邊718500 3)河南省職業病防治研究院毒理科 鄭州450052

肺癌是目前中國發病率最高的腫瘤，位于致死性癌癥的首位［1］。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是機體受到應激刺激后產生的一類高度保守的蛋白質，其主要功能是參與調控細胞內蛋白的折疊，從而保護細胞免受應激損傷。研究［2］發現，HSP70 在肺癌組織中的表達量高于正常組織。c-jun 氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)是促分裂原活化蛋白激酶超家族的成員之一，應激刺激能夠促使其激活并參與細胞凋亡的調控。研究［3］證實，誘導產生的HSP70 能夠通過影響JNK 的活化水平來抑制細胞凋亡。目前關于抑制HSP70是否能促進肺癌細胞凋亡的研究較少［4］，因此課題組利用小干擾RNA(siRNA)靶向性下調人肺腺癌細胞株A549 細胞中HSP70 的表達，觀察細胞凋亡率的變化，檢測HSP70、p-JNK 和活化型Caspase-3 的表達量，探討HSP70 在A549 細胞凋亡中的作用機制以及HSP70 作為肺癌治療的新靶點的可能性，以期為肺癌的治療提供新的思路和實驗依據。

1 材料與方法

1．1 主要材料和儀器 A549 細胞由中科院上海細胞生物研究所提供。HSP70 siRNA 由上海吉瑪制藥有限公司合成:正義鏈序列為5’-AGGACGAGUUU GAGCACAATT-3’，反義鏈序列為5’-UUGUGCU CAAACUCGUCCUTT-3’;陰性對照siRNA 正義鏈序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈序列為5’-UUGUGCUCAAACUCGUCCUTT-3’。超純RNA 抽取試劑盒、RT-PCR 定量試劑盒及哺乳動物蛋白抽提試劑盒均購于北京康為世紀生物科技有限公司。

1．2 細胞培養 在37℃、體積分數5%CO2、相對濕度95%條件下用含體積分數10%無支原體胎牛血清的RPMI 1640 培養液培養、傳代A549 細胞。

1．3 實驗分組 實驗分為3組:空白對照組(僅加入轉染試劑Lipofectamine 2000)、陰性對照組(轉染無關序列)和干擾組(轉染HSP70 siRNA)，每組均設6個復孔。轉染前1 d，將細胞密度調整到(4～5)×104mL－1，接種到12 孔板，每孔1 mL 單細胞懸液，待細胞增殖至50%～60%融合時，進行轉染。采用瞬時轉染的方法，轉染試劑為Lipofectamine 2000，嚴格按照說明書操作。

1．4 各組A549 細胞凋亡的流式細胞儀檢測 轉染48 h 后，將細胞吹打成密度不低于1．0×105mL－1單細胞懸液，用PBS 清洗2次后棄去上清，取50．0 μL 的Binding Buffer 重懸細胞后加入5．0 μL的Annexin V-FIFC 和5．0 μL 的碘化丙啶，室溫下避光反應15 min 后，用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1．5 各組A549 細胞中HSP70 mRNA 表達的實時定量PCR 檢測 轉染24 h 后，PBS 緩沖液清洗12孔板2次后，用超純RNA 提取試劑盒提取RNA 并逆轉成cDNA，以cDNA 為模板進行實時定量PCR，以β-actin 作為參照。HSP70 上游引物序列5’-CTG GAGTCCTACGCCTTCAACAT-3’，下游引物序列5’-ACACATTGGGGTAGTAGTAGTCGC-3’;β-actin 上游引物序列5’-CCAGGGCGTTATGGTAGGCA-3’，下游引物序列5’-TGGTTGACCCTGCTATACCTT-3’。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并合成。PCR 反應體系:cDNA 2．0 μL，2 ×UltraSYBR Mixture 25．0 μL，上下游引物各1．0 μL，RNase-Free水21．0 μL。PCR 反應:95℃預變性10 min;95℃變性15 s，60℃退火1 min，37個循環。采用2-ΔΔCt法計算HSP70 mRNA 的相對水平。

1．6 各組A549 細胞中HSP70、p-JNK 及Caspase-3 蛋白表達的Western blot 檢測 轉染48 h 后收集各組細胞，提取總蛋白，調整濃度，使每孔上樣量均為30 μg。蛋白樣品和上樣緩沖液按比例混勻，95℃5 min 變性后進行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳條件為80 V 40 min，120 V 90 min。電泳結束后將蛋白轉移至PVDF 膜上。用50 g/L 的脫脂奶粉溶液封閉2 h 后用TBST 溶液洗脫3次，10 min/次，然后一抗(按1∶1 000 稀釋)4℃孵育過夜，二抗(按1∶5 000 稀釋)37℃孵育2 h 以上，TBST 洗3次后，在暗室中進行ECL 顯影。用圖像分析軟件Quantity One 分析條帶的積分光密度。

1．7 統計學處理 采用SPSS 21．0 進行分析。應用單因素方差分析和LSD-t 檢驗比較各組細胞凋亡率、HSP70 mRNA 和蛋白、p-JNK 以及Caspase-3 蛋白表達水平的差異，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 A549 細胞轉染條件的確定 轉染12 h 后，在熒光顯微鏡下觀察轉染FAM 標記的NC siRNA 的A549 細胞是否成功，并使用流式細胞儀進行計數，重復3次。結果顯示轉染率穩定在80%以上。

2．2 各組細胞凋亡率、HSP70 mRNA 和蛋白、p-JNK及Caspase-3 蛋白表達的比較 見圖1、2 和表1。

圖1 各組A549 細胞中p-JNK 蛋白的表達

圖2 各組A549 細胞中Caspase-3 蛋白的表達

表1 各組細胞凋亡率、HSP70 mRNA 和蛋白、p-JNK 及Caspase-3 蛋白表達的結果(n=6)

3 討論

熱休克蛋白又稱熱應激蛋白，是生物體在熱誘導條件下合成的一組具有高度保守性的蛋白質。研究［5］證實HSP70 在正常組織或癌旁組織中低表達或不表達，而在許多惡性腫瘤組織中高表達。劉金鋼等［6］發現HSP70 與PI3K/AKT 信號傳導通路之間可能具有互相促進肝癌細胞增殖的作用，肝癌組織中HSP70、PI3K 和Akt 蛋白表達是影響患者無瘤生存期的重要因素之一，HSP70 蛋白表達量越高，患者的預后越差。RNAi 是由雙鏈RNA 介導的由特定酶參與的特異性基因沉默現象，它能夠在轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達，RNAi 介導的基因沉默具有高度特異性、高效率及高穩定性等特點，因此被廣泛地應用于探索基因功能及惡性腫瘤的治療領域［7］。作者針對HSP70 設計的siRNA 能特異性地沉默HSP70 靶基因，熒光定量PCR 及Western blot 結果表明，與其他2組相比，干擾組細胞中HSP70 mRNA 及蛋白的表達水平明顯下降。

細胞的凋亡受抑制是腫瘤細胞的主要特征之一。HSP70 作為“分子伴侶”能與癌基因、抑癌基因及其產物相互結合形成HSP70-癌蛋白復合體，使得與癌癥相關蛋白的結構與功能保持完整，從而在癌細胞中發揮抗凋亡的作用［8］。作者采用siRNA 抑制A549 細胞中HSP70 的表達后，細胞凋亡率相比空白對照組上升，這也從另一方面表明HSP70 在肺腺癌A549 細胞中發揮著抗凋亡的作用。

研究［9-10］表明，誘導型HSP70 能夠抑制JNK 的活化。作者采用RNAi 下調A549 細胞中HSP70 表達水平后，活化型JNK 表達水平下降，其原因可能是抑制了HSP70 的表達后，細胞內HSP90 反饋性增加，從而抑制活化型JNK 的表達。有研究［11］表明，在胎盤內皮細胞中HSP70 和HSP90 能夠同時調控JNK 和ERK 的表達。Caspase-3 是Caspase 家族的重要成員，是Caspase 依賴的細胞凋亡過程的最終執行者［12］。作者的研究結果顯示，采用siRNA 下調HSP70 的表達后，不但細胞凋亡增加，且伴隨有Caspase-3 水平的降低，提示siRNA 下調HSP70 可能通過Caspase-3 之外的途徑促進細胞凋亡［13］。目前已有研究［14］表明使用siRNA 抑制HSP70 的表達后，褪黑素可以反饋性地抑制其所誘導Caspase-3 的激活，甚至引起其表達水平的下降。

綜上所述，siRNA 抑制HSP70 的表達可以促進A549 細胞的凋亡，且該過程伴隨著JNK 和Caspase-3 表達水平的降低。細胞凋亡的過程是多個信號通路共同作用的結果，HSP70 可能與其他熱休克蛋白家族成員如HSP90 同時參與多個細胞信號通路的調控，具體的作用機制需進一步的研究加以證實。

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