不同正畸力對大鼠牙周組織張力側BMP-2蛋白表達的影響*

常 悅，王明潔，王月，張小平，崔淑霞

1)鄭州大學口腔醫(yī)學院 鄭州450052 2)河南省口腔醫(yī)院正畸科 鄭州450052

生理狀態(tài)下牙周組織處于成骨和破骨的動態(tài)平衡之中，在正畸力作用下牙周組織發(fā)生適應性改建，壓力側破骨細胞增生活躍，以骨吸收為主，張力側成骨細胞增生活躍，以骨生成為主。正畸過程中安全有效地加速牙齒移動一直是廣大學者關注的課題。骨形成蛋白是轉化生長因子－β 超家族成員［1］，研究［2］表明，其主要參與機體的成骨活動。骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein－2，BMP－2)是該家族中研究最廣泛、誘導活性最強且惟一能單獨誘導成骨的因子。該實驗通過建立大鼠正畸牙齒移動模型，觀察不同正畸力作用下牙周組織張力側BMP－2蛋白表達的變化，深入了解成骨細胞活化的時機和機制，為探討不同力值與牙周組織改建的關系奠定生物學基礎。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及分組 10 周齡的Wistar 大鼠60只(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物室提供，許可證號:SCXK 魯20130001)，雄性，體重210～227 g，要求牙體、牙列完整，無齲齒及牙周病變。普通飼料分籠飼養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)1 周后，將大鼠按不同力值分成4組:A組(0 g)、B組(30 g)、C組(50 g)、D組(80 g)，各15只。

1．2 材料及儀器 游標卡尺(桂林廣陸數(shù)字測控股份有限公司)，彈簧測力計(杭州西湖生物材料有限公司)，鎳鈦螺旋拉簧(北京圣馬特科技有限公司)，正畸用0．020 mm 結扎鋼絲(杭州森風齒科材料廠)，BMP－2 抗體、SP 試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1．3 大鼠正畸牙齒移動模型的建立 選擇大鼠左側第一磨牙為實驗牙，切牙為支抗牙，用100 mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉并固定大鼠。采用0．020 mm 正畸結扎鋼絲從左上第一磨牙和第二磨牙的鄰間隙穿過，并連接于預備好的鎳鈦螺旋拉簧一端備用。用牙科高速渦輪機尖頭金剛砂車針在上頜中切牙和第一磨牙的牙頸部頰側面和近中軸面制備一淺凹，用正畸測力計分別調整正畸力為0、30、50、80 g，用游標卡尺分別測量各力值拉伸的距離，另取一段結扎鋼絲連接于鎳鈦螺旋拉簧另一端并拉伸至實驗所用的力值長度，固定于中切牙的固位溝內(nèi)。以上頜2個中切牙為支抗向前移動第一磨牙。最后用樹脂粘結劑覆蓋結扎鋼絲與固位溝處以加強固位。每日檢查動物口腔并測量力值以保證力值恒定，發(fā)現(xiàn)鎳鈦螺旋拉簧脫落則重新加載。為補償螺旋拉簧應力疲勞及牙移動引起的力值衰減，每周加力1次。

1．4 牙齒移動距離的測量 各組分別于安裝牙齒移動裝置后第1、3、7、14、21天各處死3只大鼠，分離左側上頜骨，用游標卡尺測量每只大鼠上頜左側第一磨牙遠中舌溝點與第二磨牙近中舌溝點間的距離(整個測量的過程中忽略支抗的喪失)，由同一人進行測量，結果精確到0．01 mm，測量3次，取平均值。

1．5 牙周組織HE 染色觀察 處死大鼠，取上頜第一、二磨牙及周圍牙槽骨組織，多聚甲醛固定48 h。采用100 g/L EDTA(pH 7．4)于4℃條件下脫鈣4～6周，至用大頭針扎標本的牙組織感覺無阻力為止。常規(guī)乙醇梯度脫水各24 h，體積分數(shù)95%乙醇與正丁醇混合液、正丁醇各處理12 h。二甲苯透明，梯度浸蠟，60～62℃石蠟包埋，制備牙齒上頜骨近遠中方向縱切片，片厚5 μm，HE 染色，觀察牙周組織的變化情況。

1．6 牙周組織張力側BMP-2 蛋白表達的檢測 牙周組織切片脫蠟至脫水化后，體積分數(shù)3% H2O2封閉10 min，1 g/L 胰蛋白酶室溫孵育10 min 滅活內(nèi)源性酶，PBS 沖洗3次，每次2 min;滴加50 μL BMP－2 抗體(按1∶50 稀釋)。4℃過夜，PBS(pH 7．2～7．6)洗滌3次，每次10 min，37℃復溫1 h，滴加50 μL DAKO 二抗復合物，37℃孵育30 min，PBS 洗3次，每次3 min，DAB 顯色，顯微鏡下觀察顯色5～10 min。蒸餾水沖洗，蘇木素輕度復染，蒸餾水沖洗。常規(guī)脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。利用Biosens Digital Imaging System(上海山富科學儀器有限公司)高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)對BMP－2 進行定量分析。在組織切片上確定測量部位:第一磨牙根中1/3 處張力側(遠中)牙周膜的近牙骨質側。每個部位選擇3個視野，測定積分光密度值，結果取平均值。

1．7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17．0 進行統(tǒng)計分析，4組間大鼠牙齒移動距離及牙周組織張力側BMP－2蛋白表達情況的比較采用析因設計的方差分析，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 各組大鼠牙齒移動距離的比較 結果見表1。

2．2 各組大鼠牙周組織HE 染色結果 A組各時間段牙周膜近遠中間隙等寬，膠原纖維排列規(guī)則，破骨細胞少見。B組壓力側牙周膜變窄，牙槽骨邊緣可見少量的骨吸收陷窩和破骨細胞。C組牙周組織反應活躍，牙周膠原纖維排列不規(guī)則，可見大量的骨吸收陷窩和破骨細胞;張力側牙周膜間隙增寬，血管擴張，新生的成骨細胞沿牙槽骨側排列。D組壓力側牙周膜纖維排列混亂，有明顯的牙槽骨和牙骨質的吸收，破骨細胞少見;張力側牙周纖維斷裂，新生的成骨細胞和成牙骨質細胞少見。見圖1。

表1 各組大鼠牙齒移動距離的比較(n=3) mm

圖1 正畸力施加第7天各組大鼠牙周組織形態(tài)學觀察(HE，×200)

2．3 各組大鼠牙周組織張力側BMP-2 蛋白表達的檢測 結果見圖2、表2。

圖2 正畸力施加第7天各組大鼠牙周組織張力側BMP-2 蛋白的表達(SP，×400)

表2 各組大鼠牙周組織張力側BMP-2 蛋白相對表達量的比較(n=3)

3 討論

正畸力是正畸牙齒移動的關鍵因素。King等［3］觀察發(fā)現(xiàn)40～60 g 是正畸牙齒移動的適當力值范圍，可以觀察到特征性的牙齒移動及相關骨改建的過程。燕濱漪等［4］觀察發(fā)現(xiàn)，大鼠磨牙施加80～100 g 力時，壓力側出現(xiàn)廣泛的透明樣變，發(fā)生潛行性骨吸收。因此該實驗選用小力值30 g、中力值50 g、大力值80 g 來研究大鼠牙周組織的變化情況。

在正畸過程中，牙齒移動伴隨著牙槽骨的改建，因此動物實驗常以牙移動速度來動態(tài)反映骨改建的情況。該實驗結果顯示，第1～7天時B組和C組牙齒移動快，可能是因為牙齒移動前期牽拉牙周膜使其出現(xiàn)張力側增寬，牙周膜存在彈性較大張力側纖維增殖、增粗，促使牙周組織改建活躍，牙齒移動距離增大。第7～14天，各加力組牙齒移動速度較慢;組織學觀察顯示:壓力側血管壓縮、血流受阻，牙周膜內(nèi)出現(xiàn)玻璃樣變結構，牙槽骨改建停滯。第14～21天B組和C組牙齒移動距離增大，說明進入了進行性牙齒移動階段，C組移動距離最大，可能牙周組織改建活躍，說明其力值是牙槽骨改建的最適力值。而D組牙齒移動基本停滯，可見牙周組織壓力側破骨細胞較少，壓力側根中部可見牙骨質的吸收，牙槽骨表面出現(xiàn)不規(guī)則的破骨陷窩，以潛掘性吸收為主。可能是由于力值過大，牙槽骨改建受到抑制的緣故。以上說明50 g 是利于大鼠牙齒移動的最適力值，合適的正畸力促進牙周組織改建，提高矯治效能。

BMP－2 是誘導活性最強的成骨細胞因子，參與BMP－Smad 信號傳導通路［5－6］，在體內(nèi)通過自分泌和旁分泌的方式促進骨、軟骨等相關結締組織的形成［7－8］。研究［9－10］顯示BMP－2 在張力側牙周組織牙周韌帶(PDL)中，尤其在PDL 新生牙骨質和牙槽骨附近染色較強，證實其與牙槽骨的改建有關。該實驗結果顯示，A組張力側牙周組織BMP－2 染色較淺，可能是在未加力的狀態(tài)下，牙周組織以自分泌形式維持其穩(wěn)態(tài);B組BMP－2 表達相對較低，說明其激活張力側牙周膜及牙槽骨中成骨細胞和成纖維細胞的能力低，牙槽骨改建不活躍;C組BMP－2 表達增高，說明C組牙周組織改建活躍，促進張力側成骨細胞和成纖維細胞增殖和分化;D組與C組相比，差異無統(tǒng)計學意義，可能D組牙周組織破壞嚴重，牙槽骨改建延遲。

綜上所述，該實驗研究結果與機械閾值理論相一致。30 g 力時應變量很小，骨代謝處于負平衡狀態(tài)，以骨吸收為主，成骨活動不活躍，牙槽骨改建緩慢。50 g 力時，應變量增加，骨代謝進入正的平衡狀態(tài)，成骨活動活躍，以骨沉積為主，牙槽骨改建較快。80 g 力時超過牙周膜改建的最適力值，牙周組織破壞嚴重，骨代謝又進入負平衡狀態(tài)，成骨和破骨活動均不活躍，牙槽骨改建停滯。了解合適的力值在正畸治療中的重要性，既利于牙槽骨改建又可以提高牙齒移動的效能。

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