Ets2 siRNA轉染對EC9706細胞增殖、侵襲、周期和凋亡的影響*

楊 露，張楠楠，張彥婷，李慶華，許 堯，朱相展，#，關方霞1，#

1)鄭州大學生命科學學院 鄭州450001 2)鄭州大學第一附屬醫院干細胞研究室 鄭州450052

Ets 家族是最大的信號依賴轉錄因子家族，通過調節細胞的增殖、分化、凋亡及上皮-間充質的相互作用，參與許多生理和病理過程［1］。Ets2 為Ets 轉錄因子家族成員之一。近年來，越來越多的研究［2-3］表明，Ets2 的表達與腫瘤的發生發展密切相關。研究［4］發現，Ets2 在不同腫瘤組織中的表達水平存在差異，如在肺癌組織中低表達，而在乳癌組織中高表達。食管鱗狀細胞癌(簡稱食管鱗癌)是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，預后差，其發病機制尚不十分清楚。目前，關于Ets2 對食管鱗癌細胞的影響報道較少，僅有研究［5］顯示Ets2 在食管鱗癌組織中表達上調。該實驗觀察了Ets2 在多個食管鱗癌細胞株中的表達情況，并通過RNA 干擾技術沉默Ets2的表達，分析Ets2 下調對食管鱗癌細胞增殖、侵襲能力以及細胞周期的影響，從而探討Ets2 在食管鱗癌發生發展中的作用機制。

1 材料與方法

1．1 材料 食管上皮細胞Het-1A 及食管鱗癌細胞系EC1、Eca109、EC9706 購自中國科學院上海生物所細胞庫。RPMI 1640 細胞培養基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(美國HyClone 公司)，SYBR?Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)(大連寶生物工程有限公司)，Ets2 多克隆抗體(美國Santa Cruz 公司)，GAPDH、E-cadherin、Caspase-3、Bcl-2 等多克隆抗體和細胞全蛋白提取試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)，LipofectamineTM2000(美國Invitrogen 公司)，CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒(日本同仁化學研究所)，EdU 細胞增殖檢測試劑盒(廣州銳博生物有限公司)，Cell Invasion Assay Kit EC550(美國Chemicon 公司)，PI/RNase Staining Buffer 和Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit Ⅰ(美國BD 生物科學公司)。

1．2 4種細胞中Ets2 蛋白表達的檢測 Het-1A、EC1、Eca109、EC9706 細胞均使用含體積分數10%FBS 的RPMI 1640 培養基于37℃、體積分數為5%CO2的條件下培養。細胞培養至對數生長期后，應用Western blot 法檢測Ets2 蛋白。提取細胞總蛋白，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，濕轉電轉移法轉膜后用50 g/L 脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，加入Ets2 多克隆抗體(稀釋度1∶500)，4℃過夜孵育，加入相應二抗(稀釋度1∶1 000)，37℃孵育1 h，以GAPDH 作為內參蛋白，用eECL 發光液曝光，膠片經掃描儀掃描后進行灰度分析。實驗重復3次。

1．3 EC9706 細胞分組與處理 實驗所用siRNA片段由上海吉瑪公司設計、提供，共3 對干擾片段。預實驗篩選出的有效片段序列正義鏈:5'-GCAG CAACUUGAAUUUGCUTT-3'，反 義 鏈:5'-AGCAAA UUCAAGUUGCUGCTT-3'。將EC9706 細胞分為陰性對照組(NC組)，空白對照組(CON組)，轉染試劑對照組(lip2000組)和Ets2 siRNA組(siRNA組)。嚴格按照LipofectamineTM2000 說明書進行細胞轉染，轉染完成后將細胞培養板置于37℃、體積分數5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養，4 h后將含轉染復合物的培養基棄去，重新加入新鮮培養基置于培養箱中培養48 h，然后進行相關的檢測。

1．4 E-cadherin、Caspase-3 和Bcl-2 蛋白檢測 細胞按1．3 分組處理后，采用Western blot 法檢測3種蛋白的表達，具體操作同1．2。一抗為E-cadherin 多克隆抗體(1∶1 000)，Caspase-3 多克隆抗體(1∶400)，Bcl-2多克隆抗體(1∶400)。實驗重復3次。

1．5 EC9706 細胞增殖的檢測 ①EdU 熒光標記法檢測細胞增殖。細胞分組同1．3。向培養板中加入EdU 溶液，室溫孵育2 h，PBS 洗滌。40 g/L 多聚甲醛固定30 min，甘氨酸溶液孵育5 min，PBS 清洗，然后用含體積分數為0．5% TritonX-100 的PBS 漂洗。加入Apollo?染色反應液，室溫、避光孵育30 min，甲醇和PBS 分別清洗2次。最后加入Hoechst 33342 反應液，室溫、避光孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察染色細胞。400 倍視野下選取3個視野，計數EdU 染色細胞(增殖細胞)和Hoechst 33342 染色細胞(總細胞)，細胞增殖率=增殖細胞數/細胞總數×100%。實驗重復3次。②CCK-8 方法檢測細胞增殖。細胞分組同1．3，且每組設置3個復孔。轉染完成后，培養48 h，倒掉舊培養基，每孔加入100 μL 新鮮培養基和10 μL CCK-8 溶液。然后將其置于37℃、體積分數5% CO2培養箱中孵育2 h，在酶標儀450 nm 波長處讀取各孔的吸光度(A)值。計算細胞增殖抑制率，增殖抑制率= ［(對照孔A值－實驗孔A 值)/(對照孔A 值－空白孔A 值)］×100%。實驗重復3次。

1．6 EC9706 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell法。細胞分組同1．3。取300 μL 37℃預熱的無血清培養基加入到Transwell 小室的上室中，在37℃培養箱中孵育1．5 h，使ECM 膜水化;棄去培養基，將300 μL 細胞懸液(細胞密度為2 ×105mL－1)加入到上室，并將500 μL 含體積分數10% FBS 的新鮮培養基加入到下室;在培養箱中培養24 h 后，取出小室用棉球輕輕擦除上表面未遷移的細胞，向下室中加入500 μL 染色液染色20 min，然后用PBS 清洗3次，最后在顯微鏡下觀察，取9個高倍視野計數遷移細胞，計算平均值。

1．7 EC9706 細胞周期檢測 收集同1．3 分組轉染后48 h 的細胞，用PBS 洗2次，預冷的體積分數70%的冰乙醇固定，4℃過夜。1 000 r/min 離心5 min，棄去乙醇，PBS 洗2次。用0．5 mL 的PI/RNase Staining Buffer 重懸細胞，室溫孵育15 min 后用流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1．8 EC9706 細胞凋亡檢測 采用Annexin VFITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡。用不含EDTA 的胰蛋白酶消化同1．3 分組轉染后48 h 的細胞，調整細胞密度為1 ×106mL－1，取1 mL 細胞懸液，PBS 洗2次;用Binding Buffer 重懸細胞，然后向細胞懸液中加入Annexin V-FITC 和PI 各5 μL，輕輕混勻后，避光、室溫孵育15 min;向每個處理組中加入400 μL的Binding Buffer，在1 h 內上流式細胞儀檢測早期細胞凋亡率。同時每組細胞設置相應的對照組:未染色細胞、Annexin V-FITC 單染細胞、PI 單染細胞、Annexin V-FITC/PI 雙染細胞。實驗重復3次。

1．9 統計學處理 采用SPSS 17．0 處理數據。4種細胞中Ets2 蛋白表達，4組EC9706 細胞中E-cadherin、Caspase-3 和Bcl-2 蛋白表達，細胞增殖率，增殖抑制率，遷移細胞數，細胞周期分布及早期凋亡率的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSDt 檢驗。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 Het-1A、EC1、Eca109 和EC9706 細胞中Ets2蛋白的表達 結果見圖1、表1。與正常食管上皮細胞Het-1A 相比，食管鱗癌細胞EC1、Eca109 和EC9706 中Ets2 蛋白的表達均升高，其中EC9706 細胞中的表達量最高，因此選擇EC9706 細胞進行后續實驗。

圖1 Het-1A、EC1、Eca109和EC9706 細胞中Ets2 蛋白的表達

表1 不同細胞中Ets2 蛋白的表達

2．2 4組EC9706 細胞增殖的比較 EdU 法檢測結果見圖2、表2。圖2 中紅色熒光代表增殖細胞，藍色熒光代表總細胞。CCK-8 法檢測結果見表2。上述2種方法的檢測結果表明siRNA組細胞增殖率降低，增殖抑制率升高。

2．3 4組EC9706 細胞侵襲能力的比較 Transwell侵襲實驗結果見圖3、表2。結果顯示，siRNA組EC9706 細胞的侵襲能力降低。

表2 4組EC9706 細胞增殖、侵襲能力比較

2．4 4組EC9706 細胞周期的比較 見表3，由表3可知，Ets2 沉默的EC9706 細胞周期無明顯變化。

表3 4組EC9706 細胞的周期分布 %

圖2 EdU 法檢測4組EC9706 細胞增殖(×400)

圖3 4組EC9706 細胞的侵襲能力(×400)

2．5 4組EC9706 細胞凋亡及3種蛋白表達的比較結果見表4，由表4 可知，siRNA組EC9706 細胞早期凋亡率升高。Western blot 檢測E-cadherin、Caspase-3和Bcl-2 蛋白表達變化的結果見圖4、5 和表5，結果顯示，與NC組相比，siRNA組中E-cadherin 和Caspase-3蛋白表達量增加，而Bcl-2 蛋白表達量減少。

表4 4組EC9706 細胞早期凋亡率比較 %

圖4 4組EC9706 細胞E-cadherin 蛋白的表達

圖5 4組EC9706 細胞Caspase-3 和Bcl-2 蛋白的表達

表5 4組EC9706 細胞中E-cadherin、Caspase-3、Bcl-2 蛋白的表達

3 討論

轉錄因子Ets2 廣泛存在于各種細胞和組織中，但是在不同的細胞中其功能具有較大的差異性。Ets2 通過蛋白之間的相互作用或者信號介導通路參與調節細胞增殖、分化、周期和凋亡等［6］。研究［7］表明，Ets2 還參與調節胚胎血管的生成。同時，Ets2為許多信號通路的下游分子，如PI3K/AKT、Ras/Raf/MAPK 以及Ca2+依賴的有絲分裂信號通路等［8］。目前，在許多腫瘤組織中均發現了Ets2 的異常表達［9-10］，Ets2 表達失調或者與其他蛋白融合參與了許多腫瘤事件的發生。Foulds 等［11］發現Ets2對腫瘤細胞及正常細胞的生長起不同的作用。在Ras 介導癌性轉化的NIH3T3 細胞中，高表達Ets2能逆轉已發生癌性轉化的NIH3T3 細胞，使細胞趨于恢復正常的細胞形態。這與之前報道的Ets2 高表達能夠促進NIH3T3 細胞成瘤相矛盾［12］。在肺癌中亦發現針對相同細胞系，Ets2 既有致癌基因活性又有抑癌基因活性［8］。

由于Ets2 在腫瘤發生發展中的作用尚存在爭議，該研究檢測了其在食管上皮細胞Het-1A 和食管鱗癌細胞EC1、Eca109、EC9706 中的表達情況，實驗結果支持Ets2 在腫瘤細胞中表達上調的觀點，且Ets2 在EC9706 細胞中的表達量最高。為研究Ets2在食管鱗癌發展中的作用，該實驗通過RNA 干擾技術下調EC9706 細胞中Ets2 的表達，結果發現，當Ets2 表達下調后，EC9706 細胞的增殖能力和侵襲能力顯著下降，黏附因子E-cadherin 的表達升高;細胞早期凋亡比例增加，推測為Ets2 下調可下調抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，激活Caspase-3，從而促進細胞凋亡;但細胞周期無明顯變化。以上實驗證明Ets2表達下調能有效抑制食管鱗癌的發展，為進一步研究Ets2 在食管鱗癌中的生物學功能，解決其是抑癌基因或癌基因的爭議提供了實驗基礎。Shiota 等［13］發現，Ets2 能夠調節Prdx1 的表達，且與Prdx1 表達呈正相關。該實驗室前期實驗［14］證明，抑制Prdx1表達能夠阻斷mTOR/p70S6K 信號通路。由此，初步推斷轉錄因子Ets2 可能通過調節mTOR/p70S6K信號途徑參與食管鱗癌的發展過程，Ets2 可能成為食管鱗癌診斷的分子標志物和治療靶點。

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