培哚普利對心肌肥厚大鼠心肌組織中肌細胞增強因子2A表達的影響

琚肖肖，趙玉蘭，董 靜，黃亞萍

鄭州大學第二附屬醫(yī)院心內科鄭州450014

目前，舒張性心力衰竭的發(fā)病率、病死率不斷上升，已成為心血管病研究的熱點。而心肌肥厚是舒張性心力衰竭的主要病因，是心臟為適應血流動力學超負荷而發(fā)生的增生。雖然心肌肥厚早期改變對于維持正常心功能有一定的代償意義，但它本身也會增加心肌耗氧量，降低心肌順應性，長期心肌肥厚會導致心力衰竭并增加猝死發(fā)生率［1］。心肌肥厚是心肌細胞對多種刺激因素產(chǎn)生的適應性反應，是一個復雜的病理反應過程。肌細胞增強因子2A(myocyte enhancer factor 2A，MEF2A)是MEF2 家族中的重要一員，在骨骼肌、心肌、平滑肌的分化及血管的發(fā)育中起著重要作用［2-3］。該研究旨在通過建立大鼠心肌肥厚模型，觀察MEF2A 在正常大鼠、心肌肥厚大鼠、藥物干預大鼠心肌組織中的表達情況，了解MEF2A 影響心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的機制及培哚普利對其影響。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及試劑 健康雄性SPF 級Wistar 大鼠30只，體重300～350 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物室提供。鹽酸異丙腎上腺素(ISO)注射液，2 g/L，上海合豐制藥有限公司生產(chǎn);培哚普利，8 mg/片，施維雅制藥有限公司生產(chǎn)。RT-PCR試劑盒(Transgene 公司)，瓊脂糖(西班牙生化試劑公司)，PCR 引物(北京博大泰克公司)，SP 試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，MEF2A 抗體(北京博奧森生物技術有限公司)。

1．2 動物模型制備 30只Wistar 大鼠應用隨機數(shù)字表法分為3組，每組10只。①模型組:大鼠皮下注射ISO 3 mg/(kg·d)。②藥物干預組:大鼠皮下注射ISO 3 mg/(kg·d)，培哚普利1 mg/(kg·d)溶于2 mL 飲用水中灌胃。③對照組:大鼠皮下注射與ISO 等劑量的生理鹽水，灌胃與培哚普利等劑量的生理鹽水。各組均連續(xù)處理10 d。

1．3 心臟重量參數(shù)測定 10 d 后，測量3組大鼠的體重，麻醉后開胸取出心臟，剪去心臟周圍的血管及組織，用預冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，然后稱全心重量，沿冠狀溝剪去左心房，再沿室間溝剪去右室游離壁，稱左心室重量，計算全心重量/體重比(HW/BW)、左心室重量/體重比(LVW/BW);將左心室心肌組織分為兩部分，一部分放入液氮中儲存，另一部分放入40 g/L 多聚甲醛中固定24 h。

1．4 心肌組織的HE 染色 將多聚甲醛固定的心肌組織石蠟包埋，4 μm 厚切片，脫蠟后行常規(guī)HE染色，鏡下觀察各組心肌組織的形態(tài)學變化。

1．5 RT-PCR 檢測心肌組織中MEF2A mRNA 的表達 以GAPDH 為內參，上游引物5'-CGGCAAGT TCAACGGCACGC-3'，下游引物5'-GCCTGCTTCAC CACCTTCTT-3'，擴增片段大小636 bp;MEF2A 上游引物5'-TTCACTCGTGTCACCGTCTT-3'，下游引物5'-TCTGGTTTCCGACTGTTCAT-3'，擴增片段大小333 bp。提取心肌組織總RNA，按說明書步驟進行逆轉錄反應。PCR 擴增條件為:94℃預變性2 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán);72℃延伸6 min，55℃退火15 s。取5 μL擴增產(chǎn)物與緩沖液混合后加入瓊脂糖凝膠的加樣孔中，進行電泳。EB 染色后，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140 圖像記錄分析系統(tǒng)進行分析，MEF2A mRNA 的相對表達量以MEF2A 和GAPDH條帶灰度值的比值表示。

1．6 免疫組化檢測心肌組織中MEF2A 蛋白的表達 采用免疫組化SP 法。石蠟切片經(jīng)脫蠟水化、在PBS 溶液中浸泡、修復抗原、加入多克隆抗體、DAB 染色、蘇木素復染等步驟，然后進行分色、洗滌、脫水、透明、封片等，最后用顯微鏡進行觀察，MEF2A 蛋白染色后在心肌細胞中呈棕色顆粒。應用Lecia 圖像采集系統(tǒng)，在400 倍視野下進行觀察，選取5個染色較均勻區(qū)域測量陽性細胞的灰度值，結果取平均值。

1．7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17．0 進行數(shù)據(jù)分析。3組間HW/BW、LVW/BW、MEF2A 蛋白及mRNA相對表達量的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 3組大鼠HW/BW 和LVW/BW 的比較 結果見表1。

表1 3組大鼠HW/BW、LVW/BW、MEF2A mRNA 及蛋白相對表達量的比較

2．2 3組大鼠心肌組織的病理學變化 對照組大鼠心肌細胞無明顯改變，細胞核居中，心肌細胞排列整齊;模型組可見心肌細胞明顯肥大，排列紊亂，間質纖維結締組織增生明顯;藥物干預組心肌細胞較模型組稍小，間質纖維結締組織增生較少。見圖1。

圖1 3組大鼠心肌組織HE 染色結果(×400)

2．3 3組大鼠心肌組織中MEF2A mRNA 的表達RT-PCR 檢測3組大鼠心肌組織中MEF2A mRNA的相對表達量，結果為:模型組＞藥物干預組＞對照組。見圖2 和表1。

2．4 3組大鼠心肌組織中MEF2A 蛋白的表達MEF2A 蛋白在心肌細胞中表現(xiàn)為棕色顆粒。對照組心肌細胞中可見少量棕色顆粒;模型組中可見大量棕色顆粒;藥物干預組中可見部分棕色顆粒，較模型組少。見圖3 和表1。

圖2 3組大鼠心肌組織中MEF2A mRNA 的表達

圖3 3組大鼠心肌組織中MEF2A 蛋白免疫組化染色結果(SP，×400)

3 討論

心肌肥厚是一種以心臟質量增加為特征的病理生理改變，可繼發(fā)于多種心血管疾病，最常見的是高血壓病。在高血壓的初期，心臟后負荷增加導致心臟泵血阻力增加，心臟代償性肥厚以克服增加的壓力負荷，但是持續(xù)的壓力超負荷引起心肌肥厚失代償，進而出現(xiàn)猝死、心律失常、心力衰竭等心血管意外［4］。血管緊張素Ⅱ、內皮素以及TGF-β 等因子通過多條通路誘導心肌蛋白合成，使心肌細胞增大，促進心肌肥厚的發(fā)生［5-6］。MEF2A 是p38MAPK 信號通路下游的重要調節(jié)因子，在信號傳導、肌肉組織中結構蛋白的形成中發(fā)揮重要的作用［7-8］。該研究通過免疫組化及RT-PCR 的方法分別檢測MEF2A 蛋白及mRNA 的表達情況，發(fā)現(xiàn)MEF2A 蛋白及mRNA 在模型組的表達均高于對照組，說明MEF2A 可能通過p38MAPK 信號通路介導心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展［9］。

該研究通過比較3組大鼠HW/BW、LVW/BW、MEF2A mRNA 及蛋白相對表達量發(fā)現(xiàn)，培哚普利干預后，HW/BW、LVW/BW 及MEF2A mRNA 和蛋白的相對表達量均低于模型組，提示MEF2A 在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中起著促進作用，同時說明培哚普利可抑制MEF2A 的表達，進而抑制心肌肥厚的發(fā)生。

綜上所述，培哚普利可減輕肥厚心肌組織的病理改變，通過調控MEF2A 的表達發(fā)揮抑制心肌肥厚的作用。

［1］Berenji K，Drazner MH，Rothermel BA，et al．Does load-induced ventricular hypertrophy progress to systolic heart failure?［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289(1):H8

［2］Wang BW，Chang H，Kuan P，et al．Angiotensin Ⅱactivates myostatin expression in cultured rat neonatal cardiomyocytes via p38 MAP kinase and myocyte enhance factor 2 pathway［J］．J Endocrinol，2008，197(1):85

［3］Dionyssiou MG，Nowacki NB，Hashemi S，et al．Cross-talk between glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) and p38MAPK regulates myocyte enhancer factor 2(MEF2)activity in skeletal and cardiac muscle［J］．J Mol Cell Cardiol，2013，54(7):35

［4］司林杰，許晶，易晨龍，等．積雪草酸抑制小鼠主動脈縮窄術后心肌肥厚形成［J］．南京醫(yī)科大學學報:自然科學版，2014，34(9):1168

［5］Yu M，Zheng Y，Sun HX，et al．Inhibitory effects of enalaprilat on rat cardiac fibroblast proliferation via ROS/P38MAPK/TGF-β1 signaling pathway［J］．Molecules，2012，17(3):2738

［6］王蒙，陳紹良．P38MAPK 信號通路與心血管疾病關系的研究進展［J］．現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2012，12(30):5968

［7］Ye J，Cardona M，Llovera M，et al．Translation of myocyte enhancer factor-2 is induced by hypertrophic stimuli in car-diomyocytes through a calcineurin-dependent pathway［J］．J Mol Cell Cardiol，2012，53(4):578

［8］Potthoff MJ，Olson EN．MEF2:a central regulator of diverse developmental programs［J］．Development，2007，134(23):4131

［9］盛紅專，楊笛，張寄南．培哚普利對腎血管性高血壓大鼠心肌鈣調神經(jīng)磷酸酶及絲裂原活化蛋白激酶的影響［J］．中華心血管病雜志，2004，32(11):999