人參皂苷Rd對高糖致人牙周膜干細胞成骨分化抑制作用的影響

王慧麗，謝 冰，李 欣，藺燕萍，張 朋

1)鄭州大學附屬鄭州中心醫院口腔科 鄭州450007 2)鄭州大學口腔醫學院修復科 鄭州450052

△女，1974年12月生，本科，主治醫師，研究方向:牙體牙髓牙周病，E-mail:wanghl501@163．com

牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是牙周組織中存在的未分化的間充質細胞，具有自我更新和多向分化等特點。21 世紀以來，糖尿病已成為世界各國共同面對的一項公共健康問題，而糖尿病會大大增加牙周炎的發病率［1］。人參皂苷Rd (ginsenoside Rd，GSRd)是人參皂苷的主要活性單體之一，具有廣泛的生物活性，如保護心血管及腎臟功能、促進細胞生長等［2-3］。作者觀察了高糖誘導條件對PDLSCs 增殖及分化的影響，進一步分析GSRd 對高糖誘導PDLSCs 成骨分化的影響，報道如下。

1 材料與方法

1．1 試劑及儀器 胎牛血清、2．5 g/L 胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、Dispase 酶(HyClone 公司，美國)，GSRd(廣東泰和生物制藥有限公司)，α 極限必需培養基(α-MEM)、Trizol Reagent(Invitrogen 公司，美國)，骨橋蛋白(OPN)抗體、超氧化物歧化酶(SOD)抗體、過氧化氫酶(CAT)抗體、內參抗體、羊抗兔抗體(Abcam 公司，美國)，逆轉錄試劑盒、即用型混合液(Roche 公司，瑞士)，倒置顯微鏡(Olympus 公司，日本)，酶聯免疫檢測儀(Biorad 公司，美國)，PCR 儀(Aplied Biosystems 公司，美國)。

1．2 PDLSCs 的分離、培養及實驗分組 經患者知情同意后，取根中1/3 牙周膜組織，剪成約1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，移入15 mL 離心管，加入3 g/L 的Ⅰ型膠原酶和4 g/L 的Dispase 酶，37℃消化1 h。將細胞移于含體積分數10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素各1 ×105U/L 的α-MEM 培養液重懸。調整細胞密度為1 ×107L－1，接種于6 孔板，置于37℃、體積分數5%CO2孵箱中。每3 d 換液1次，棄去未貼壁的細胞。細胞達80%左右融合時，用胰蛋白酶消化傳代。實驗均取第4～7 代細胞，均重復6次。觀察高糖對堿性磷酸酶(ALP)活性影響時，設對照組和高糖組，觀察時間為第4、7天;觀察正常條件下GSRd 對ALP 活性的影響時，設對照組和0．1、1．0、10．0、40．0、100．0 μmol/L GSRd 處理組;觀察高糖條件下GSRd 對ALP、骨鈣蛋白(OCN)、OPN、SOD、CAT 表達的影響時，設高糖組、對照組和高糖+10(或40)μmol/L GSRd 處理組，ALP 活性檢測時間為第4、7、14天。

1．3 PDLSCs 表面標記物的檢測 取第4 代PDLSCs，2．5 g/L 胰蛋白酶消化并離心，棄上清液，用冷PBS 洗3次后再用含體積分數30%的胎牛血清的PBS 重懸，調細胞密度至2 ×109L－1;將細胞懸液分裝于EP 管中(100 μL/管)，設定其中一管為裸細胞作為對照，其余分別加入相應的抗體2 μL，室溫避光孵育1 h，離心棄上清后冷PBS 洗3次，用500 μL 含體積分數30%胎牛血清的PBS 重懸，4℃避光保存。用流式細胞儀檢測CD34、CD29、CD90、CD45、CD146 等表面標記物的表達情況。

1．4 PDLSCs 的成骨分化 將PDLSCs 轉移到含體積分數5%胎牛血清的α-MEM 培養基，培養基同時含50 mg/L 抗壞血酸、1 μmol/L 地塞米松及3 mmol/L β-磷酸甘油。細胞孵育時分別添加5 mmol/L D-葡萄糖(正常組)或30 mmol/L D-葡萄糖(高糖組);GSRd 濃度分別為0．1、1．0、10．0、40．0、100．0 μmol/L。培養基每2 d 換液1次。

1．5 ALP 活性測定 細胞用PBS 洗滌2次并溶解在含體積分數1% Triton X-100 和1 mmol/L PMSF的Tris-HCl 緩沖液(pH 7．0)中。使用Bradford 方法進行總蛋白定量，在405 nm 波長處測吸光度值，并用總蛋白標準化ALP 活性。

1．6 ALP、OCN、SOD、CAT mRNA 表達的檢測用Trizol Reagent 提取細胞總RNA。ALP 上游引物5'-GCAGTATGAATTGAATCGGAACAAC-3'，下 游 引物5'-ATGGCCTGGTCCATCTCCAC-3';OCN 上游引物5'-ACCATCTTTCTGCTCACTCTGCT-3'，下游引物5'-CCTTATTGCCCTCCTGCTTG-3';SOD 上游引物5'-TCAATCAAGAGGGTGAAAAGAAGCC-3'，下游引物5'-TGACAAAGTTAGCATTGCATCCTCG-3';CAT 上游引物5'-AGCGACCAGATGAAGCAGTG-3'，下游引物5'-TCCGCTCTCTGTCAAAGTGTG-3';內參β-actin 上游引物5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下游引物5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'。將每個樣本的總RNA(1 μg)逆轉錄為cDNA。反應體系的體積為20 μL，包括10 μL 2 ×FastStart Universal SYBR Green Master、1 μL cDNA、0．5 μL 上游引物、0．5 μL 下游引物及8 μL 雙蒸水。反應條件為:94℃預變性2 min;94℃15 s，56℃10 s，72℃30 s，共39個循環;72℃延伸8 min，并采用2－ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1．7 OPN、SOD、CAT 蛋白表達的檢測 將提取的總蛋白(20 μg)使用100 g/L 的SDS-PAGE 分離膠分離，并轉移到NC 膜。TBST 洗膜，50 g/L 脫脂奶液封閉1 h。滴加一抗4℃孵育過夜，TBST 洗膜，滴加二抗孵育1 h，TBST 洗膜，曝光。采用Image J 圖像分析軟件測定蛋白條帶的灰度值。

1．8 統計學處理 采用SPSS 17．0 進行數據分析。對照組和高糖組ALP 活性的比較采用兩獨立樣本的t檢驗;其他指標不同組間的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 PDLSCs 的形態學觀察 牙周膜組織用酶消化法培養3～7 d 后，可見長梭形、多角形的類成纖維樣細胞從組織塊中爬出，2 周左右達70%～80%融合(圖1)。

圖1 PDLSCs 形態(×100)

2．2 PDLSCs 表面標記物鑒定結果 PDLSCs 表面標記物陽性表達率為:CD90 (99．32 ± 0．03)%、CD29 (98．35 ±0．05)%、CD146 (93．38 ±0．02)%、CD34 (2．77 ±0．01)%、CD45 (2．21 ±0．01)%，符合間充質干細胞表達特點。

2．3 高糖對PDLSCs ALP 活性的影響 結果見表1。

表1 高糖對PDLSCs ALP 活性的影響 mol/g

2．4 GSRd 對PDLSCs ALP 活性的影響 結果見表2、3。

表2 正常條件下GSRd 對PDLSCs ALP 活性的影響 mol/g

表3 高糖條件下GSRd 對PDLSCs ALP 活性的影響 mol/g

2．5 GSRd 對高糖誘導PDLSCs 成骨相關因子ALP、OCN、OPN 表達的影響 結果見表4。

2．6 GSRd 對高糖誘導PDLSCs SOD、CAT 表達的影響 結果見表5。

表4 GSRd 對高糖誘導PDLSCs ALP、OCN 及OPN 表達的影響

表5 GSRd 對高糖條件下CAT、SOD mRNA 及蛋白表達的影響

3 討論

流行病學研究［4-5］發現糖尿病與牙周病之間的關聯度很高，甚至牙周炎被提議作為糖尿病的第六并發癥。糖尿病患者的高血糖水平可以改變PDLSCs 的再生能力，從而影響牙周組織的修復和再生。在該研究中，作者首先證實高糖條件對PDLSCs成骨分化的抑制效應，在高糖組的第4 和7天，ALP的活性較對照組顯著下降，預示著高糖減低了PDLSCs 的成骨活性。接著，作者對PDLSCs 應用GSRd 進行預處理，發現10、40 μmol/L GSRd 抑制了由高糖誘導的ALP 活性的下降，改善了高糖條件下PDLSCs 成骨分化的能力，提示GSRd 可以用于治療伴糖尿病型牙周炎。

為了進一步探討GSRd 在高糖對PDLSCs 成骨分化影響中的作用，作者通過PCR 檢測發現成骨基因ALP 和OCN 表達量在高糖條件下較對照組顯著下降，而應用10、40 μmol/L GSRd 預處理后ALP 和OCN mRNA 的表達量較高糖組顯著提高。同樣通過免疫印跡的方法作者發現，高糖組OPN 蛋白表達量較對照組顯著下降，應用10、40 μmol/L GSRd 預處理后OPN 蛋白表達量較高糖組升高。ALP、OCN、OPN 被認為是組織發生礦化［6］、成骨細胞活性［7］的重要指標。這些結果說明GSRd 對高糖致PDLSCs成骨分化抑制起到了改善作用。

伴糖尿病型牙周炎患者的PDLSCs 長期暴露在高濃度葡萄糖中，會誘導細胞的氧化應激反應加劇，從而產生不利影響，使后期缺損牙槽骨的再生能力減弱。因此，去除氧化的因素及提高抗氧化酶的表達和活性可能會有利于伴糖尿病型牙周炎患者牙周組織的再生。在該研究中作者發現，高糖組PDLSCs 抗氧化酶CAT 及SOD 的mRNA 和蛋白表達量較對照組顯著下降，而應用10、40 μmol/L GSRd 預處理后mRNA 和蛋白的表達量較高糖組升高。這些結果與以前的研究［8-11］結果類似，表明GSRd 可以提高抗氧化酶的表達和活性，進而起到清除氧自由基的作用。

綜上，作者發現GSRd 對體外培養的PDLSCs 的成骨分化有一定的促進作用，且GSRd 可以減輕高糖條件下氧化應激對PDLSCs 成骨的抑制作用，顯著改善高糖狀態下ALP、OCN mRNA 及OPN 蛋白表達量的降低，進而對高糖條件下PDLSCs 的成骨分化提供了保護作用，為使用GSRd 治療伴糖尿病型牙周炎提供了理論基礎。

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