瑞芬太尼聚己內(nèi)酯對脊髓缺血再灌注損傷兔體感誘發(fā)電位的影響*

方 華，章建平#，張競超，章放香，王泉云，王儒蓉，劉 進(jìn)

1)貴陽醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院麻醉科 貴陽550002 2)四川大學(xué)華西醫(yī)院麻醉科 成都610041

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI)是引起繼發(fā)性脊髓損傷的重要機(jī)制［1-2］。SCIRI 引起的輕癱或截癱發(fā)生率高達(dá)21%［3］。目前，SCIRI 發(fā)生的病理生理機(jī)制尚未完全闡明。瑞芬太尼聚己內(nèi)酯(remifentanil-poly-caprolactone，REM-PCL)是由方華等［4］自行研制開發(fā)并已獲得國家正式授權(quán)的一種新型高分子Mu 阿片受體(Mu-opioid receptor，MOR)激動(dòng)劑，前期研究已證實(shí)腹主動(dòng)脈內(nèi)灌注REM-PCL 0．1 mg/kg 預(yù)處理可能對SCIRI 具有重要的治療價(jià)值。為了進(jìn)一步研究REM-PCL 對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制，該研究觀察了SCIRI 模型兔腹主動(dòng)脈內(nèi)局部灌注REM-PCL 后體感誘發(fā)電位(somatosensory-evoked potential，SEP)的變化規(guī)律，并通過神經(jīng)行為學(xué)評估和脊髓組織病理學(xué)觀察，探討REM-PCL 的脊髓保護(hù)作用。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 REM-PCL(中國發(fā)明專利號:200810045272．8)，阿片受體拮抗劑GSK1521498(美國Sigma 公司)，均溶解于5 mL 生理鹽水中。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)ELISA 檢測試劑盒(美國USCNLIEF 公司)，RevertAidTM第一鏈cDNA 合成試劑盒(美國Fermentas 公司)，BL-420S 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，PCR 引物、β-actin 及3S Trizol 總RNA 提取試劑盒(上海博彩生物科技有限公司)。

1．2 SCIRI 動(dòng)物模型的建立 采用左腎動(dòng)脈下方腹主動(dòng)脈夾閉法建立SCIRI 兔模型。經(jīng)耳緣靜脈按30 mg/kg 的劑量注射戊巴比妥鈉麻醉兔后，右股部褪毛、常規(guī)消毒、鋪巾，逐層切開暴露，仔細(xì)分離并顯露右側(cè)股動(dòng)脈，經(jīng)右側(cè)股動(dòng)脈向腹主動(dòng)脈內(nèi)置入硬膜外導(dǎo)管，使導(dǎo)管遠(yuǎn)端位于左腎動(dòng)脈起始點(diǎn)下方1 cm 處，固定導(dǎo)管，接傳感器測壓。置管前5 min 經(jīng)耳緣靜脈注射肝素1 mg/kg。左腹股溝區(qū)備皮，消毒鋪巾，腹正中開腹后顯露腹主動(dòng)脈及左腎動(dòng)脈，并于左腎動(dòng)脈分支下方約0．5 cm 處用動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈。證實(shí)股動(dòng)脈平均動(dòng)脈壓波形變?yōu)橹本€后，阻斷腹主動(dòng)脈血流以造成腰段脊髓缺血損傷。阻斷45 min 后松鉗開放腹主動(dòng)脈，恢復(fù)脊髓血液灌注，以造成腰段脊髓再灌注損傷。血壓穩(wěn)定后，取出導(dǎo)管，結(jié)扎右側(cè)股動(dòng)脈，見腹主動(dòng)脈搏動(dòng)恢復(fù)、無血管嚴(yán)重?fù)p傷及腹腔滲血后，予甲硝唑10 mL 沖洗腹腔預(yù)防感染，確切止血，逐層關(guān)腹，觀察24 h。術(shù)中以生理鹽水浸潤的溫紗墊覆蓋腹腔臟器，直腸溫度維持于36～37℃。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法 健康新西蘭大白兔30只(四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，雌雄不限，體重2．0～2．5 kg，手術(shù)當(dāng)日晨禁食，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、REM-PCL (R)組和 REM-PCL +GSK1521498組(RG組)，每組10只。R組和RG組按1．2 方法制備SCIRI 動(dòng)物模型;對照組麻醉后僅進(jìn)行手術(shù)操作，不阻斷腹主動(dòng)脈。R組和RG組阻斷腹主動(dòng)脈血流時(shí)，經(jīng)腹主動(dòng)脈局部灌注REM-PCL 0．1 mg/kg，5 min 內(nèi)灌注完畢;RG組于REM-PCL 灌注結(jié)束后15 min 時(shí)再局部灌注GSK1521498 1 mg/kg，5 min 內(nèi)灌注完畢;對照組局部灌注等容量生理鹽水。術(shù)中采用i-STAT 血?dú)夥治鰞x(美國)間斷測定動(dòng)脈血?dú)猓B續(xù)監(jiān)測經(jīng)皮脈搏氧飽和度、心電圖、平均動(dòng)脈壓及直腸溫度。

1．4 觀察指標(biāo)

1．4．1 SEP 測量 采用BL-420S 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，于阻斷前，再灌注15、30、60 min 及再灌注24 h 時(shí)測定SEP。刺激:將兩根直徑0．5 mm 單極銀針電極間距2．5 cm 插入左小腿腓腸肌，進(jìn)行電脈沖刺激;刺激頻率4 Hz，強(qiáng)度5 mA。記錄:用ST-7 型腦立體定位儀固定兔頭部，顱骨正中矢狀線上17．5 mm、向右側(cè)旁開3．5 mm 處采用牙科鉆鉆開一直徑為3．0 mm的圓孔，顯露硬腦膜(相當(dāng)于左后肢感覺投射區(qū))，并將直徑2．0 mm 無菌單極銀球記錄電極安放至圓孔內(nèi)，保持電極與硬腦膜接觸良好且不損傷腦組織。SEP 起始潛伏期(OL)的記錄為刺激開始至P1 波波峰出現(xiàn)的時(shí)間，單位為ms;SEP 峰間波幅(IPA)為N1 波波峰至P1 波波谷的幅度，單位為μV;觀察SEP 形態(tài)(即波形)，包括各波的時(shí)空分布、位相和出現(xiàn)率。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后還原顱骨瓣并縫合頭皮。

1．4．2 血清NSE 的檢測 各組分別于阻斷前，再灌注15、30、60 min 及再灌注24 h 時(shí)自股靜脈采血5 mL，5 000 r/min 離心后取上清，采用雙抗體夾心ELISA 法測定血清NSE 質(zhì)量濃度。

1．4．3 神經(jīng)行為學(xué)評定 于再灌注6、12 和24 h時(shí)，由不了解分組情況的兩名觀測者進(jìn)行動(dòng)物后肢感覺、運(yùn)動(dòng)反射功能評估及神經(jīng)功能評分，每例均測試3次，取其平均值。根據(jù)Reuter 等評分標(biāo)準(zhǔn)［5］進(jìn)行綜合評價(jià)。

1．4．4 后角神經(jīng)元計(jì)數(shù) 再灌注24 h 時(shí)，神經(jīng)行為學(xué)評定完成后，再次麻醉兔，迅速完整取出L3～L4 節(jié)段脊髓組織固定于福爾馬林中，常規(guī)HE 染色，采用Olympus BX51 圖像采集分析系統(tǒng)等距隨機(jī)抽樣法觀察脊髓組織病理學(xué)變化，參照文獻(xiàn)［6］計(jì)數(shù)脊髓后角(Ⅰ～Ⅵ區(qū))正常和異常感覺神經(jīng)元，并計(jì)算感覺神經(jīng)元異常率。神經(jīng)元異常率=所選視野中異常神經(jīng)元數(shù)/該視野中神經(jīng)元總數(shù)×100%。

1．4．5 MOR mRNA 的表達(dá) 再灌注24 h 時(shí)，神經(jīng)行為學(xué)評定完成后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測脊髓組織中MOR mRNA 的表達(dá)。使用Primier 5．0軟件，根據(jù)PubMed 中基因序列設(shè)計(jì)MOR、β-actin的引物和探針。MOR 探針:5'-CTACAACATGTTC ACCAGCATCTTCACGCTCACCA-3'，MOR 正向引物:5'-AAGGCTGTGCTCTCCATTGAC-3'，MOR 反向引物:5'-CCCAACACCTGAAGCCAAGAC-3'。β-actin 探 針:5'-CAACGAGCGGTTCCGATGCCCT-3'，β-actin 正向引物:5'-ACGGCCAGGTCATCACTATTG-3'，β-actin 反向引 物:5'-CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA-3'。定 量方法參照文獻(xiàn)［7］。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16．0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。3組SEP、神經(jīng)行為學(xué)評分和血清NSE 質(zhì)量濃度的比較采用重復(fù)測量的方差分析，3組MOR mRNA 表達(dá)和感覺神經(jīng)元異常率的比較采用單因素方差分析和SNK-q 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 術(shù)后動(dòng)物一般情況觀察 手術(shù)結(jié)束2 h 內(nèi)動(dòng)物均完全清醒。實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均無意外死亡，手術(shù)切口均愈合良好，無感染。對照組、R 和RG組截癱率分別為10/10、5/10 和8/10。

2．2 SEP 變化 見表1。再灌注后，3組兔SEP OL均延長，IPA 均降低。R組IPA 于再灌注30 min 時(shí)恢復(fù)至阻斷前水平，對照組和RG組于再灌注60 min 時(shí)恢復(fù)至阻斷前水平。再灌注期間各時(shí)間點(diǎn)，R組OL 均小于對照組和RG組。

表1 SEP 變化

2．3 神經(jīng)行為學(xué)觀察 見表2。術(shù)前動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)評分均為0 分。再灌注各時(shí)間點(diǎn)3組后肢神經(jīng)行為學(xué)評分均較術(shù)前顯著增加，但R組明顯低于對照組和RG組。

表2 神經(jīng)行為學(xué)評分變化

2．4 血清NSE 質(zhì)量濃度變化 見表3。

表3 3組血清NSE 質(zhì)量濃度變化 μg/L

2．5 MOR mRNA 表達(dá)變化 見表4。再灌注24 h 時(shí)R組脊髓組織MOR mRNA 表達(dá)較對照組和RG組明顯增加。

2．6 感覺神經(jīng)元異常率 見表4。再灌注24 h，R組感覺神經(jīng)元異常率明顯低于對照組和RG組。

表4 3組再灌注24 h 脊髓組織中MOR mRNA 表達(dá)及感覺神經(jīng)元異常率的比較

3 討論

研究［8］發(fā)現(xiàn)，MOR 在調(diào)節(jié)神經(jīng)、精神、內(nèi)分泌活動(dòng)以及呼吸、心血管生理功能活動(dòng)中具有重要作用。SCIRI 可引起脊髓組織中MOR mRNA 表達(dá)顯著降低，且MOR mRNA 表達(dá)變化與NSE 變化顯著相關(guān)，提示MOR 表達(dá)變化與SCIRI 引起神經(jīng)元損傷的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，MOR 表達(dá)下降不利于缺血脊髓組織血液供應(yīng)恢復(fù)后的神經(jīng)功能恢復(fù)。REMPCL 為MOR 激動(dòng)劑，極易通過血脊屏障。該研究觀察了腹主動(dòng)脈內(nèi)局部灌注REM-PCL 對SCIRI 兔SEP 的影響，探討REM-PCL 的脊髓保護(hù)作用。

研究中，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著腹主動(dòng)脈內(nèi)局部灌注REM-PCL 劑量的增加，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)功能障礙逐漸減輕，表現(xiàn)為后肢神經(jīng)功能的恢復(fù)及截癱率的下降，最佳劑量為0．1 mg/kg，故研究中0．1 mg/kg 為REM-PCL 實(shí)驗(yàn)劑量。麻醉藥物不僅可以影響SCIRI 程度，還可能通過影響呼吸和循環(huán)系統(tǒng)引起缺氧，進(jìn)一步加重脊髓損傷。一些靜脈麻醉藥物和心血管活性藥物對缺血神經(jīng)元有明顯保護(hù)或損傷作用，如氯胺酮通過拮抗N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體而產(chǎn)生脊髓保護(hù)作用［9］。因此，實(shí)驗(yàn)中僅靜脈注射30 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物并保留自主呼吸，且不應(yīng)用其他具有心血管活性的藥物。實(shí)驗(yàn)中腹主動(dòng)脈阻斷和開放期間所有動(dòng)物均未發(fā)生缺氧，血?dú)獗O(jiān)測值均無明顯變化，術(shù)后2 h 內(nèi)動(dòng)物完全蘇醒，說明研究采用的麻醉方式合適，并且0．1 mg/kg REM-PCL 的灌注劑量對內(nèi)分泌系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等均無負(fù)性影響，未發(fā)生體溫降低、呼吸抑制和心律失常等不良反應(yīng)，可以安全使用。采用阻斷腹主動(dòng)脈方法主要引起L3～L4 脊髓節(jié)段損傷，同一節(jié)段主要累及前角及后角，與此同時(shí)，腹主動(dòng)脈阻斷法建立SCIRI 模型具有經(jīng)濟(jì)、手術(shù)操作過程簡單、重復(fù)性好以及缺血再灌注效果確切等特點(diǎn)。

研究［10-13］表明，SEP 作為客觀性和敏感性更好的檢測方法能夠準(zhǔn)確地反映脊髓感覺功能受損的程度。SEP 經(jīng)脊髓后索和后外側(cè)索傳導(dǎo)，能夠直接、客觀地反映脊髓感覺傳導(dǎo)束的機(jī)能狀態(tài)［14-16］。SEP IPA 主要與有效傳導(dǎo)纖維數(shù)目及動(dòng)作電位大小有關(guān)，OL 主要與傳導(dǎo)路徑中的突觸數(shù)目、突觸延擱時(shí)間、神經(jīng)髓鞘的脫失和受損有關(guān)［17-18］。SEP 與運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)束之間存在一定聯(lián)系，也可作為評價(jià)后肢運(yùn)動(dòng)功能的間接指標(biāo)［19］。血清NSE 水平是一種測定方法簡便、特異性和敏感度高的神經(jīng)元或神經(jīng)細(xì)胞損傷標(biāo)志。SCIRI 過程中，神經(jīng)元細(xì)胞膜完整性破壞，NSE 由胞內(nèi)釋放至胞外，通過血脊屏障進(jìn)入循環(huán)［20］，提示外周血NSE 水平變化可反映SCIRI 程度及用于SCIRI 預(yù)后評估。

該研究結(jié)果顯示，對照組再灌注24 h 內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的SEP OL 逐漸并持續(xù)延長，IPA 于再灌注初期急劇降低，隨后逐漸恢復(fù)至阻斷前水平;與此同時(shí)，血清NSE 質(zhì)量濃度隨著再灌注時(shí)間的延長而逐漸升高，并于再灌注24 h 時(shí)達(dá)到最高，說明神經(jīng)元持續(xù)受損。RG組上述指標(biāo)測值及變化趨勢與對照組相似。而再灌注期間R組OL 延長程度小于對照組和RG組，IPA 亦于再灌注30 min 時(shí)即恢復(fù)至阻斷前水平;與此同時(shí)，R組血清NSE 質(zhì)量濃度雖然也升高，但始終明顯低于對照組和RG組，并于再灌注60 min 時(shí)開始降低，至再灌注24 h 時(shí)恢復(fù)至阻斷前水平;再灌注期間R組神經(jīng)行為學(xué)評分始終低于對照組和RG組;再灌注24 h 時(shí)，R組脊髓組織MOR mRNA 表達(dá)水平明顯高于對照組和RG組，感覺神經(jīng)元異常率明顯低于對照組和RG組。

該研究結(jié)果說明，阻斷-開放腹主動(dòng)脈引起SCIRI 后脊髓損傷區(qū)域感覺神經(jīng)纖維功能降低，有效傳導(dǎo)纖維數(shù)量減少，傳導(dǎo)速度下降，且受損傷的神經(jīng)元興奮性下降，因此不能形成正常的SEP。REM-PCL對脊髓感覺傳導(dǎo)通路產(chǎn)生保護(hù)作用，使脊髓缺血期間感覺神經(jīng)纖維及神經(jīng)元破壞減少，可使缺血脊髓恢復(fù)血液灌注后感覺神經(jīng)纖維及神經(jīng)元功能恢復(fù)加快，在一定程度上增強(qiáng)了該通路將感覺神經(jīng)形成的動(dòng)作電位向大腦皮層傳遞的能力，該保護(hù)作用可能與MOR 的激活有關(guān)。

綜上所述，經(jīng)導(dǎo)管腹主動(dòng)脈內(nèi)局部灌注REMPCL 預(yù)處理缺血脊髓組織可減輕SCIRI 引起的脊髓電生理功能損害，并具有促進(jìn)損傷感覺神經(jīng)纖維和神經(jīng)元的電生理功能恢復(fù)的作用。

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