乳癌患者轉移淋巴結中T細胞受體β鏈互補決定區3譜型分析*

張建波，呂曉東，宋 巍，孫淼淼，于慶凱，馮 穩，劉明閣，胡 駿，房百俊

1)鄭州大學附屬腫瘤醫院病理科 鄭州450003 2)鄭州大學附屬腫瘤醫院中心實驗室 鄭州450003 3)中山大學中山醫學院微生物學教研室 廣州510089 4)鄭州大學附屬腫瘤醫院血液科 鄭州450003

T 細胞在抗腫瘤免疫中起重要作用，并以識別腫瘤相關抗原的T 細胞克隆性增生為特點［1］。研究［2］證實多種實體瘤患者體內存在針對腫瘤抗原特異反應的T 細胞克隆，分析這些克隆性增生的T細胞對于了解機體抗腫瘤的免疫狀態以及開展特異性免疫治療有重要意義。該研究旨在分析乳癌患者轉移淋巴結中T 細胞的克隆性增生及T 細胞受體(T cell receptor，TCR)β 鏈互補決定區3(complementarity determining region 3，CDR3)亞家族基因譜型及氨基酸序列特點，為尋找乳癌患者腫瘤相關抗原表位及個體化免疫治療等打下基礎。

1 材料與方法

1．1 標本 鄭州大學附屬腫瘤醫院確診為乳腺浸潤性導管癌(組織學Ⅱ級)的住院患者5例，均為女性，年齡28～73歲，取其經術中快速冰凍病理檢查明確有癌微轉移的腋窩前哨淋巴結標本。同時取2例乳腺反應性增生患者的淋巴結標本作為對照。該研究經鄭州大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準。

1．2 主要試劑 Trizol 試劑、SuperScript Ⅲ逆轉錄酶、SMART 引物、LD PCR 引物ⅡA 購自美國Invitrogen 公司，Advantage 2 Polymerase Mix 購自美國BD Biosciences Clontech 公司，Taq DNA 聚合酶購自美國Promega 公司，膠純化試劑盒購自美國Omega Biotek 公司。

1．3 RNA 提取及cDNA 合成 將癌轉移淋巴結及對照淋巴結的新鮮標本在200 目篩網上研磨后用PBS 沖洗，收集細胞懸液，加入1 mL 無血清RPMI 1640 培養液并計數。用Trizol 試劑提取總RNA，在SuperScript Ⅲ逆轉錄酶及SMART 引物作用下合成cDNA，在LD PCR 引物ⅡA 作用下合成cDNA 第2 鏈。

1．4 24個TCR β 鏈可變區(BV)亞家族的擴增根據文獻［3］設計24個TCR BV 亞家族上游引物，并在β 鏈恒定區(C 區)設計一條共用的FAM 標記的下游引物和對照引物，引物由上海英駿生物技術有限公司合成。總反應體系為50 μL，反應條件為:94℃預變性3 min;94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，35個循環;72℃延伸10 min。取7 μL PCR 反應產物在15 g/L 瓊脂糖凝膠中電泳。

1．5 基因掃描分析 取5 μL 熒光引物擴增的TCR BV 各亞家族PCR 產物與3 μL DNA 變性膠上樣緩沖液混合，加入0．5 μL 標準品。94℃4 min 后上樣至60 g/L 聚丙烯酰胺凝膠，于373 DNA 序列分析儀(ABI，Perkin Elmer)中電泳，計算機收集電泳過程中出現的不同顏色和強度的熒光素，用GeneScan 672軟件進行基因掃描分析。

1．6 序列分析 將GeneScan 掃描分析提示單克隆或寡克隆增生的cDNA 重新進行PCR 擴增(條件同1．4)，上游引物不變，下游引物改為未用FAM 標記的C 區引物。PCR 產物經純化回收后送上海英駿生物技術有限公司測序，利用DNAstar 軟件及網上TCR 資源(http://imgt．cines．fr/)進行序列分析。

2 結果

2．1 兩種淋巴結TCR BV 各亞家族RT-PCR 擴增結果 RT-PCR 擴增結果顯示對照淋巴結全部24個BV 亞家族均有擴增。乳癌病例1、2、4 的轉移淋巴結中24個BV 亞家族均有擴增，病例3 的BV7 家族和病例5 的BV13、BV16 家族無擴增，其余家族均有擴增，病例5 的24個TCR BV 亞家族的擴增結果見圖1。

圖1 病例5 的24個TCR BV 亞家族PCR 擴增結果

2．2 兩種淋巴結TCR BV 亞家族基因掃描結果2例對照淋巴結各BV 亞家族均有表達，基因掃描均呈中間高兩邊低、多個峰的譜型，提示為多克隆。乳癌病例1 的BV2、病例2 的BV4 掃描分析結果為單一主峰和少數小峰圖像，提示為寡克隆增生;病例3的BV18、病例4 的BV14、病例5 的BV2 和BV19 為單一主峰即單克隆增生，其余BV 亞家族為寡克隆趨勢和多克隆增生。5例乳癌患者T 細胞部分TCR BV 亞家族T 細胞克隆性特點見表1，其余亞家族均為多克隆表達。

表1 5例乳癌患者部分TCR BV 亞家族T 細胞克隆性特點

2．3 TCR β 鏈CDR3 序列測定結果 乳癌患者單克隆及寡克隆增生T 細胞TCR β 鏈CDR3 區核苷酸及氨基酸序列見表2。不同病例限制性取用的BV 亞家族不同，病例1 和病例5 均取用了BV2 家族，但其核苷酸序列不同。各亞家族CDR3 區序列長度為30～45 bp。

表2 乳癌患者T 細胞TCR BV 亞家族β 鏈限制性取用和CDR3 區核苷酸及氨基酸序列測定結果

3 討論

T 細胞通過TCR 識別腫瘤細胞相關抗原，在機體抗腫瘤免疫反應中起著重要作用［4］。腫瘤患者浸潤淋巴細胞中存在針對腫瘤抗原的特異性增生T細胞克隆。不同克隆T 細胞的TCR 重排時，V-D-J基因片段重排和隨機插入核苷酸形成一高度可變區，稱為CDR3，是TCR 特異識別抗原的區域。CDR3 長度及堿基序列的不同形成了T 細胞表面多種多樣的TCR CDR3 基因譜型［5］。分析CDR3 基因譜型是一種獨特的檢測T 細胞克隆性的方法。PCR-基因掃描-序列分析方法通過檢測CDR3 的長度是否相同以確定T 細胞的克隆性，然后對出現單克隆或寡克隆的PCR 產物進行序列分析，從而了解其CDR3 的核苷酸序列，是檢測T 細胞克隆性較為理想的方法［6］。

作者利用該方法分析了5例乳腺浸潤性導管癌(組織學Ⅱ級)患者轉移淋巴結內克隆性增生T 細胞。與乳腺反應性增生患者T 淋巴細胞表達全部(24個)TCR BV 亞家族不同，乳癌患者TCR BV 亞家族表達存在明顯的限制性取用，每例患者均出現一個或多個TCR BV 亞家族的譜型偏移，表明乳癌患者轉移淋巴結內存在針對乳癌細胞釋放的腫瘤相關抗原的特異免疫反應性T 細胞克隆性增生，而且這些優勢克隆性增生的T 細胞會影響其他家族T細胞的表達。5例患者選擇性表達的TCR BV 亞家族亦不同，分析其原因可能為:乳癌腫瘤相關抗原具有復雜性和多樣性，不同的抗原表位可誘發機體產生針對性的BV 亞家族優勢表達，同時也與不同患者之間人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)型別存在差異、疾病病程的不同階段TCR 取用情況不同等有關［7］。該研究中2例乳腺浸潤性導管癌患者均表達了BV2 亞家族，是否BV2 亞家族T細胞克隆是乳腺浸潤性導管癌腫瘤相關抗原的特異性效應T 細胞克隆，有待進一步研究。基因掃描結果顯示，5例乳腺浸潤性導管癌患者大部分BV 亞家族基因呈多克隆表達，這是因為病變淋巴結中仍存在一些正常BV 亞家族T 細胞，而且T 細胞對腫瘤相關抗原的反應性克隆性增生也處于一個動態過程中。雖然病例1 和病例5 的3個克隆產物CDR3 序列長度相同，但其氨基酸序列完全不同，證實為不同的T 細胞克隆。有研究［7］提示TCR 識別抗原時，除HLA 型外，TCR CDR3 本身的結構和空間構型也有影響，不同譜型的CDR3 如果空間結構相似很可能會識別相同的抗原表位［8］，因此有必要對該研究中不同患者之間多樣性的CDR3 譜型進行生物信息學分析，了解其是否具有相似的空間結構。

乳癌患者體內存在T 細胞的克隆性增生，一方面說明T 細胞參與了機體的抗腫瘤免疫應答反應，可考慮采用特異性的TCR β 鏈單克隆抗體活化腫瘤自體T 細胞，獲得臨床治療數量的特異性細胞毒T 細胞，用于乳癌患者的個體化免疫治療;另一方面也說明了機體內存在誘導T 細胞克隆性增生的腫瘤相關抗原。因此，監測乳癌根治術后患者體內T細胞克隆性增生情況，可為分析患者是否有微小腫瘤殘留及腫瘤復發提供依據和對比指標［9］。

總之，該研究分析了5例乳癌患者轉移淋巴結標本中TCR β 鏈譜型偏移，表明患者體內存在T 細胞的克隆性增生，有助于了解患者的細胞免疫功能狀態。進一步的CDR3 氨基酸序列分析既證實克隆性增生T 細胞來自不同的T 細胞群，也為分析乳癌腫瘤相關抗原表位、疫苗研制，進行個體化免疫治療等提供了幫助。

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