口腔扁平苔蘚患者口腔黏膜超微結構特征和細胞凋亡檢測*

李相如，朱奎成，喬 彬

1)鄭州大學第一附屬醫院口腔科 鄭州450052 2)鄭州大學實驗動物中心 鄭州450052

△女，1975年12月生，碩士，主治醫師，研究方向:口腔黏膜病，E-mail:sywfirst@163．com

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)是一種發生在口腔黏膜的慢性炎癥性疾病，為口腔黏膜癌前狀態，其組織病理學表現以上皮基底層角質形成細胞液化、變性、壞死以及固有層的T 淋巴細胞帶狀浸潤為主要特征。OLP 的發病機制尚不清楚［1］，目前很多學者［2-4］傾向于認為OLP 是一種自身免疫性疾病，病變主要源自細胞介導的免疫反應。OLP病損組織中淋巴細胞凋亡可能是持續的炎性細胞浸潤的一個主要原因［5］。細胞液化、變性可能與淋巴細胞浸潤所導致的角質形成細胞凋亡有關，并已證實膠樣小體即為凋亡小體［6］。該研究擬觀察OLP患者口腔黏膜超微結構特征以及病損區細胞凋亡的變化，為進一步探討OLP 的發病機制提供理論和實驗依據。

1 對象與方法

1．1 研究對象 2010年1月至2013年12月在鄭州大學第一附屬醫院經組織病理學確診的OLP 初診患者35例(OLP組，含普通型10例，糜爛型25例)，男18例，女17例，年齡15～70歲，所有患者均為單純性口腔損害，無全身性疾病。選取沒有全身性疾病并且最近半年未接受任何治療的10 名健康人作為正常對照組。研究經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會審議批準，并獲得所有受試者的知情同意。

1．2 病理學觀察 取正常對照組口腔黏膜組織及OLP組病損區組織標本，常規固定、脫水、包埋、切片后，行HE 染色，光鏡下觀察病理學表現。

1．3 超微結構的觀察 上述2種組織用戊二醛固定、脫水、滲透、包埋，制備厚度為50 nm 的超薄組織切片，透射電鏡下觀察組織超微結構。

1．4 細胞凋亡檢測 采取Dispase 冷酶消化法。PBS 漂洗上述2種組織塊，2．5 g/L Dispase 消化1～2 h。再用PBS 漂洗，顯微外科手術鑷分離上皮層及上皮下層。將上皮層加入到混合消化液［V(0．5 g/L 胰蛋白酶)∶V(0．2 g/L EDTA)=1∶1］中，37℃振蕩消化5～8 min，加小牛血清終止消化，吸管吹打成單細胞懸液，計數細胞。調整細胞密度為5 ×105mL－1，取1 mL 細胞懸液，1 000 r/min 離心10 min，棄上清液后，加入10 μL Annexin V-FITC(Intergen公司，美國)，反應30 min，加入300 μL Binding-Buffer 及5 μL PI，上流式細胞儀檢測。計算凋亡細胞百分率。

1．5 統計學處理 采用SPSS 17．0 處理數據，采用兩獨立樣本的t 檢驗比較2組凋亡細胞百分率，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 病理學特征 正常對照組口腔黏膜組織病理學檢查未見異常(圖1A、B)。OLP組病損區口腔黏膜的組織病理學改變為:上皮過度角化或者角化不全，以棘層的增生最為多見;上皮形狀不規則，表現為鋸齒狀;基底層角質細胞排列紊亂，基底膜邊界不清，基底細胞液化、變性、壞死;固有層中可見密集的淋巴細胞浸潤帶，該浸潤帶主要分布在固有層的淺層，部分還可深入到固有層的深層或者黏膜下層。23例OLP 患者在上皮的基底層、棘層或黏膜固有層中可以見到圓形或者卵圓形、均質性及嗜酸性的膠狀小體，15例出現了上皮輕度不典型增生，細胞排列較亂、細胞層次增多、極性消失(圖1C、D)。

圖1 2組口腔黏膜組織病理學檢查結果(HE，×400)及OLP組超微結構的改變(×6 000)

2．2 超微結構 OLP組上皮棘層內角質細胞胞質內充滿排列紊亂的張力原纖維，內質網擴張，內含不定形物，線粒體腫大，峭消失，游離核糖體增多。多數細胞器減少，細胞核呈團塊狀且異染色質增多，核周間隙增寬，出現核旁空泡，細胞變形，橋粒結構破壞，細胞間隙明顯擴大?；准毎c基底膜半橋粒及細胞間橋粒被破壞、分離，部分細胞變形、排列紊亂、錯位，水腫細胞間隙增寬，出現空泡、變性，胞質內線粒體腫脹，峭明顯減少(圖1E、F)。細胞核增大，異染色質增多，凋亡細胞增多。凋亡細胞主要表現為染色質沿核膜邊聚，且呈“C”形、新月形或團塊狀，并可見凋亡小體(圖1G、H)。正常對照組口腔黏膜超微結構未見異常。

2．3 細胞凋亡檢測結果 OLP組與正常對照組凋亡細胞百分率分別為(30．06 ±4．56)%和(7．70 ±0．69)%，差異有統計學意義(t=15．392，P＜0．001)。

3 討論

為探討OLP 的發生與細胞凋亡之間的關系，該研究首先對35例OLP 患者進行病損區病理學觀察，結果顯示其組織病理學主要表現為:黏膜上皮表層的過度角化或者不全角化;部分上皮層出現輕度增生樣的改變，固有層出現淋巴細胞帶狀聚集;基底層角質細胞出現不同程度的液化、變性、壞死，基底層等可見嗜酸性膠狀小體，該膠狀小體有可能是由凋亡的角質形成細胞所形成。使用透射電鏡觀察OLP 病變組織的超微結構，發現OLP 病變組織的角質細胞核發生變性，棘層角質細胞的間隙明顯增寬，基底細胞線粒體腫脹，線粒體的內嵴消失，出現核旁空泡，角質細胞結構不完整，基底膜與基底層角質細胞分離，上皮細胞內出現凋亡小體，說明OLP 病變組織上皮內存在細胞凋亡。這與以往的研究［7-8］結果一致。以上這些形態學的變化表明OLP 患者體內存在細胞免疫反應，T 細胞有可能先是在病損的某個部位被激活，然后再到達口腔黏膜，并穿越已表達內皮細胞黏附分子的內皮細胞從而進入到結締組織，再進而攻擊基底層的角質形成細胞，最終產生病損。

檢測細胞凋亡的方法除了形態學觀察外，定量檢測常常使用TUNEL 法、流式細胞術、DNA 凝膠電泳等方法。目前國內外最常用的凋亡定量檢測方法是TUNEL 法，但該法最大缺點是壞死細胞亦呈現TUNEL 反應陽性［9］。該研究使用流式細胞術結合Annexin V 聯合PI 法，即對凋亡細胞雙染后用流式細胞儀檢測凋亡細胞。其優勢在于:流式細胞術檢測早期細胞凋亡較TUNEL 法更為靈敏，而且Annexin V 聯合PI 染色不需固定細胞，可避免PI 染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL 法因固定出現的DNA 片段丟失。因此，Annexin V 聯合PI 法更加省時，結果更為可靠，是目前最為理想的檢測細胞凋亡的方法。

目前有關OLP 的發生與凋亡關系的研究結果不盡一致。Dekker 等［7］在研究中發現OLP組織中存在凋亡，周威等［10］卻發現OLP組凋亡細胞率低于正常組?？谇火つそM織上皮角質形成細胞的分離較為困難。該研究利用可以獲得單一角質形成細胞的冷酶消化法［11］分離OLP組織及正常口腔黏膜組織中的上皮角質形成細胞，采用流式細胞術檢測上述組織的細胞凋亡。結果顯示:OLP組凋亡細胞百分率高于正常對照組。提示OLP 的發生可能與上皮細胞凋亡的異常有關，有可能是在細胞因子的作用下，淋巴細胞的凋亡受到抑制，進而更多的淋巴細胞發揮更大的淋巴細胞毒作用，從而對組織造成損傷。

綜上所述，該研究初步證實了細胞凋亡異常在OLP 發病中發揮著重要作用。然而，細胞凋亡在OLP 的發生中可能只是眾多步驟中的一環，其具體機制仍需進一步研究。

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［5］雷蕾，譚為霞，于淼，等．口腔扁平苔蘚局部淋巴細胞增殖細胞核抗原、Bcl-2、Bax 的表達［J］．南方醫科大學學報，2009，29(5):946

［6］Thakur M，Hazare V．Scanning electron microscopic study of surface epithelial cells in erosive and nonerosive oral lichen planus［J］．J Contemp Dent Pract，2012，12(6):463

［7］Dekker NP，Lozada-Nur F，Lagenaur LA，et al．Apotosis-associated markers in oral lichen planus［J］．J Oral Pathol Med，1997，26(4):170

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［9］Gorczyca W，Gong JP，Darzynkiewicz Z．Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays［J］．Cancer Res，1993，53(8):1945

［10］周威，金巖，吳織芬，等．口腔扁平苔蘚上皮細胞凋亡狀況的分析和意義［J］．牙體牙髓牙周病學雜志，2001，11(5):321

［11］Yamashita K，Yotsuyanagi T，Yamauchi M，et al．Klotho mice:a novel wound model of aged skin［J］．Plast Reconstr Surg Glob Open，2014，2(1):e101