5-ALA介導(dǎo)的光動力療法對人舌鱗癌TCA8113細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響*

王 桃，劉偉偉，謝 冰，張 瑞，張 朋#

1)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院修復(fù)科 鄭州450052 2)鄭州市口腔醫(yī)院綜合科 鄭州450099 3)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院口腔科鄭州450007

光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是一種聯(lián)合光敏劑及相應(yīng)光源，通過光動力作用選擇性破壞病變組織的臨床治療手段［1］。5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)屬于第2 代光敏劑，是一種內(nèi)源性光動力治療藥物。作者將5-ALA 介導(dǎo)的PDT(5-ALA-PDT)作用于體外培養(yǎng)的人舌鱗癌Tca8113 細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，為5-ALA-PDT 用于舌鱗癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要材料 5-ALA(上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司)，MTT、DMSO(Sigma 公司)，Tca8113 細(xì)胞(第四軍醫(yī)大學(xué)組織工程中心贈予)，細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，胎牛血清(Gibco 公司)。PDTLAS 半導(dǎo)體激光治療儀(上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司)，多功能酶標(biāo)儀(Bio-Rad 公司)，倒置顯微鏡(Olympus 公司)，流式細(xì)胞檢測儀(Beckman 公司)。

1．2 5-ALA-PDT 對Tca8113 細(xì)胞形態(tài)影響的觀察取對數(shù)生長期Tca8113 細(xì)胞，按2×104mL－1密度接種于96 孔板中，24 h 后進(jìn)行分組及處理［正常對照組、僅光照組、僅光敏劑組(5．00 mmol/L 5-ALA)、低濃度5-ALA-PDT組(0．05 mmol/L 5-ALA+PDT 治療)、高濃度5-ALA-PDT組(5．00 mmol/L 5-ALA+PDT治療)］。各組細(xì)胞經(jīng)處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于倒置顯微鏡下(×200)觀察細(xì)胞生長狀況。

1．3 MTT 法檢測5-ALA-PDT 對Tca8113 細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期Tca8113 細(xì)胞，按2 ×105mL－1密度接種于96 孔板中，37℃培養(yǎng)24 h，吸出含血清的培養(yǎng)液，PBS 液輕漂后棄去，于暗室中分別加入0．01、0．05、0．10、0．50、1．00、5．00、10．00 mmol/L的5-ALA，各劑量組依次孵育1、2、3、4、6、8 h，然后用波長635 nm、光能量密度4 J/cm2的激光進(jìn)行光照刺激［2］。同時(shí)設(shè)立不施加任何干預(yù)的對照組。每組4個復(fù)孔。給予干預(yù)后各孔補(bǔ)加100 μL 含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT 液20 μL，37℃避光孵育4 h，后棄去上層液體，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min 后混勻，然后用酶標(biāo)儀于490 nm 波長處檢測各組細(xì)胞的吸光度值。

1．4 流式細(xì)胞儀檢測5-ALA-PDT 對Tca8113 細(xì)胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期Tca8113 細(xì)胞，按5 ×105mL－1密度接種于6 孔板中，每孔500 μL，37℃培養(yǎng)24 h，吸出含血清的培養(yǎng)液，PBS 液輕漂后棄去。實(shí)驗(yàn)分組:O組(正常對照組);A組(0．05 mmol/L 光敏劑);B組(0．50 mmol/L 光敏劑);C組(5．00 mmol/L 光敏劑)。藥物組給予波長635 nm、光能量密度4 J/cm2的激光進(jìn)行光照刺激2 h，然后各孔補(bǔ)加100 μL 含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各組細(xì)胞胰蛋白酶消化后用PBS洗滌2次，收集(1～5)×105個細(xì)胞，加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，加入5 μL Propidium Iodide 混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，上流式細(xì)胞儀檢測。每組重復(fù)3次。

1．5 流式細(xì)胞儀檢測5-ALA-PDT 對Tca8113 細(xì)胞周期的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞，按5 ×105mL－1密度接種于6 孔板中，每孔500 μL，37℃培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分組:D組用5-ALA-PDT 處理細(xì)胞(0．5 mmol/L 5-ALA 作用2 h，光照刺激同1．3)，E組不施加任何干預(yù)。24 h 后收集細(xì)胞，用PBS 洗滌2次，制備的單細(xì)胞懸液用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇固定，4℃保存，染色前用PBS 洗去固定液，加100 μL RNase A 37℃水浴30 min，再加入400 μL PI 染液混勻，4℃避光30 min，上流式細(xì)胞儀檢測并記錄結(jié)果。每組重復(fù)3次。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組間Tca8113 細(xì)胞增殖情況的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析;4組間Tca8113 細(xì)胞凋亡率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn);2組間Tca8113 細(xì)胞周期的比較采用兩獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 5-ALA-PDT 對Tca8113 細(xì)胞形態(tài)的影響 見圖1?？梢?，單純光照和光敏劑作用于細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;當(dāng)5-ALA-PDT 作用于細(xì)胞時(shí)細(xì)胞形態(tài)改變明顯，細(xì)胞體積變小，皺縮變圓，甚至出現(xiàn)裂解;高濃度5-ALA-PDT組細(xì)胞形態(tài)的改變較低濃度5-ALA-PDT組明顯。

圖1 5-ALA-PDT 對Tca8113 細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)

2．2 5-ALA-PDT 對Tca8113 細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響 見表1～3。

表1 5-ALA-PDT 對Tca8113 細(xì)胞增殖的影響(n=4)

表2 5-ALA-PDT對Tca8113 細(xì)胞凋亡的影響(n=3) %

表3 5-ALA-PDT 對Tca8113 細(xì)胞周期的影響(n=3) %

3 討論

PDT 已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療多種疾病，尤其是腫瘤疾病［3］。與腫瘤傳統(tǒng)手術(shù)、化療和放療方法相比，PDT 的優(yōu)點(diǎn)是能選擇性地消滅局部的原發(fā)和復(fù)發(fā)腫瘤，而不傷及正常組織;并可與化療和放療同時(shí)進(jìn)行，且均具有一定的協(xié)同作用;另外還可縮小手術(shù)的范圍和改善患者的愈后［4］。有學(xué)者［5-7］將Photofrin 等光敏劑單獨(dú)或者聯(lián)合手術(shù)、放療用于舌癌的臨床治療，取得了很好的近期效果。5-ALA 是一種內(nèi)源性光敏劑，近年來因其不良反應(yīng)少、避光時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛重視［8-9］。該課題組之前的研究［10］表明，5-ALA-PDT 對舌鱗癌細(xì)胞具有殺傷效應(yīng)。

該實(shí)驗(yàn)中通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)光敏劑、激光分別單獨(dú)作用于Tca8113 細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;當(dāng)5-ALA-PDT 作用于Tca8113 細(xì)胞時(shí)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞體積減小，由多邊形皺縮為圓形，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，甚至出現(xiàn)裂解。5-ALA-PDT 所致的細(xì)胞形態(tài)的改變與宗麗菊等［11］采用PDT 誘導(dǎo)的人宮頸永生化上皮H8 細(xì)胞形態(tài)改變是一致的。這說明5-ALA-PDT 對舌鱗癌細(xì)胞的形態(tài)有影響，可能誘發(fā)細(xì)胞凋亡。利用MTT 法檢測發(fā)現(xiàn)，5-ALA-PDT 作用的各組吸光度值均低于對照組，說明5-ALA-PDT 能夠抑制Tca8113 細(xì)胞的增殖。該實(shí)驗(yàn)還利用流式細(xì)胞儀檢測了5-ALA-PDT對Tca8113 細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示PDT 作用各組凋亡及壞死率均比對照組高。這說明5-ALA-PDT能夠誘導(dǎo)Tca8113 細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。在對細(xì)胞周期的檢測中發(fā)現(xiàn)，5-ALAPDT 干預(yù)后G0/G1期細(xì)胞所占百分比高于對照組，S 期細(xì)胞低于對照組，G2/M 期細(xì)胞略低于對照組，表明5-ALA-PDT 干擾了細(xì)胞周期中G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變的階段，從而抑制了細(xì)胞的代謝和增殖。此與光鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)改變及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

綜上所述，5-ALA-PDT 對Tca8113 細(xì)胞有確切的殺傷作用。在一定濃度范圍內(nèi)，其殺傷作用隨著5-ALA 濃度的遞增而增加，且該作用存在濃度飽和現(xiàn)象。這種殺傷是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的，并且5-ALA-PDT 通過干擾細(xì)胞周期的G0/G1期而抑制細(xì)胞的增殖，提示5-ALA-PDT 在口腔舌鱗癌的治療中可以起重要作用。

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