SP-D基因SNP與河南漢族人群肺結(jié)核相關(guān)性分析

雷冬梅，張 玲，楚天驕，李曉文，肖 海

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科 鄭州450052 2)漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校醫(yī)學(xué)生物學(xué)教研室 漯河462002 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室 鄭州450052 4)鄭州大學(xué)人民醫(yī)院河南省醫(yī)學(xué)遺傳研究所 鄭州450002

SP-D 基因定位于10q22．2-23．1，與甘露糖結(jié)合蛋白和SP-A 基因相鄰［1］。目前SP-D 基因研究［2］大多集中于氨基酸殘基11 密碼子(SP-D11)和氨基酸殘基160 密碼子(SP-D160)多態(tài)性在肺部感染性疾病中的作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多嚴(yán)重慢性和炎癥性肺部疾病患者血清中SP-D 水平升高，如間質(zhì)性肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、特發(fā)性肺纖維化、囊性纖維化和嗜酸性肺炎等［3-4］。有研究［2］表明SP-D160 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與潰瘍性結(jié)腸炎有關(guān)。Floros 等［5］研究發(fā)現(xiàn)在墨西哥人群中，SP-D11 位點(diǎn)等位基因C 是肺結(jié)核的危險(xiǎn)性因素，SP-D160 位點(diǎn)則與肺結(jié)核發(fā)病無關(guān)。關(guān)于SP-D11 和SP-D160 位點(diǎn)SNP 與肺結(jié)核易感性之間的關(guān)系，國(guó)內(nèi)尚無報(bào)道。作者通過對(duì)河南漢族人群中SP-D11 和SP-D160 位點(diǎn)SNP 進(jìn)行研究，以期從分子水平上分析SP-D 與肺結(jié)核的相關(guān)性，探究河南漢族人群肺結(jié)核的易感基因。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象 肺結(jié)核組:為2010年至2012年收集的197例來自河南新鄉(xiāng)、安陽(yáng)及鄭州市結(jié)核病防治所的肺結(jié)核患者，男88例，女109例，年齡(36．5 ±15．3)歲，＜45歲136例，≥45歲61例;診斷均符合國(guó)家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)［6］，排除糖尿病、使用激素及免疫力低下的個(gè)體。對(duì)照組200例，男90例，女110例，年齡(32．1 ±14．6)歲，＜45歲134例，≥45歲66例，均為正常個(gè)體。以上研究對(duì)象之間無血緣關(guān)系，并均得到本人或監(jiān)護(hù)人知情同意。

1．2 SP-D11 和SP-D160 位點(diǎn)SNP 檢測(cè) 抽取研究對(duì)象的靜脈血3 mL，EDTA 抗凝，酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，應(yīng)用引物特異性PCR(SSP-PCR)法進(jìn)行檢測(cè)。引物序列(表1)來源于GenBank 和相關(guān)文獻(xiàn)［7］，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，同時(shí)設(shè)立內(nèi)對(duì)照引物APC 和HLA-DRB1 作為質(zhì)控引物。PCR 反應(yīng)體系:模板DNA 2 μL，Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，補(bǔ)充去離子水至20 μL。PCR 擴(kuò)增條件:96℃預(yù)變性1 min;96℃20 s，70℃45 s，72℃25 s，5個(gè)循環(huán);96℃25 s，65℃50 s，72℃30 s，21個(gè)循環(huán);96℃30 s，60℃55 s，72℃120 s，4個(gè)循環(huán);4℃保存。20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳:取PCR 產(chǎn)物8 μL 加入樣品孔，120 V 穩(wěn)壓電泳45 min。在凝膠成像儀紫外燈下觀察結(jié)果并保存圖像。

1．3 基因型判讀 瓊脂糖凝膠電泳中相鄰2個(gè)泳道為同一樣本的2種不同特異性引物的擴(kuò)增體系，若2 份擴(kuò)增體系均有目的條帶出現(xiàn)，則該樣本為雜合基因型;若僅有1 份體系擴(kuò)增出目的條帶，則說明樣本為該特異性擴(kuò)增引物的純合基因型。SP-D11位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為200bp，質(zhì)控條帶為800 bp;SP-D160 位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為577 bp，質(zhì)控條帶為200 bp。每個(gè)SNP 位點(diǎn)的3種基因型擴(kuò)增產(chǎn)物各抽取2例，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物序列

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SHEsis 軟件http://analysis．bio-x．cn/myAnalysis．php 在線分析數(shù)據(jù)，并進(jìn)行基因單倍型分析。應(yīng)用SPSS 10．0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)比較2組基因型頻率和等位基因型頻率的差異，并計(jì)算比值比(OR 值)和95%置信區(qū)間(CI)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

197例肺結(jié)核患者和200例正常對(duì)照者全部得到明確的基因型，SP-D11 位點(diǎn)有3種基因型CC、CT 和TT，SP-D160 位點(diǎn)有3種基因型AA、AG 和GG(圖1、2)，測(cè)序結(jié)果與電泳結(jié)果完全一致。SPD11 和SP-D160 位點(diǎn)等位基因頻率及基因型頻率分布和年齡分層分析結(jié)果見表2～7。

圖1 SP-D11 T/C 位點(diǎn)各基因型電泳圖

圖2 SP-D160 A/G 位點(diǎn)各基因型電泳圖

表2 SP-D11 基因型和等位基因在肺結(jié)核組和對(duì)照組的分布例(%)

表3 SP-D11 SNP 在肺結(jié)核組和對(duì)照組≥45歲人群中的比較例(%)

表4 SP-D11 SNP 在肺結(jié)核組和對(duì)照組＜45歲人群中的比較例(%)

表5 SP-D160 基因型和等位基因在肺結(jié)核組和對(duì)照組的分布例(%)

表6 SP-D160 SNP 在肺結(jié)核組和對(duì)照組≥45歲人群中的比較例(%)

表7 SP-D160 SNP 在肺結(jié)核組和對(duì)照組＜45歲人群中的比較例(%)

3 討論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病之一，可累及全身多個(gè)臟器，但以肺結(jié)核最為常見［8］。最近的研究［9］表明:SP-D 不僅可以識(shí)別和清除肺內(nèi)異物和凋亡細(xì)胞，而且在降低炎癥反應(yīng)、抑制自身抗體的產(chǎn)生等方面也有重要作用。基因多態(tài)性可引起蛋白結(jié)構(gòu)和功能上的改變，導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌感染者的不同轉(zhuǎn)歸，即不同個(gè)體對(duì)肺結(jié)核表現(xiàn)出不同的易感性［10］。該研究中SP-D 基因的2個(gè)SNP 位點(diǎn)均可能發(fā)生錯(cuò)義突變，這些錯(cuò)義突變可引起SP-D 蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而決定不同人群對(duì)肺結(jié)核的易感性不同。

因我國(guó)肺結(jié)核患者在45歲以下人群中明顯增多，故該研究以45歲為節(jié)點(diǎn)進(jìn)行年齡分層分析。研究結(jié)果顯示，SP-D11 位點(diǎn)CC、TT 基因型在肺結(jié)核組中的分布頻率均低于對(duì)照組，CT 基因型在肺結(jié)核組中的分布頻率則高于對(duì)照組，且與年齡無關(guān)，表明該位點(diǎn)的基因型頻率與河南漢族人群肺結(jié)核發(fā)病有關(guān)。推測(cè)該基因不是肺結(jié)核發(fā)病的主基因，而只是在復(fù)雜的遺傳方式中起了較微弱的作用。

作者對(duì)SP-D160 位點(diǎn)進(jìn)行基因型頻率與基因頻率分析，總體人群分析結(jié)果顯示其與河南漢族人群肺結(jié)核發(fā)病無關(guān)。但按年齡分層分析結(jié)果顯示，45歲以下人群A 等位基因在肺結(jié)核組的分布頻率高于對(duì)照組，提示此位點(diǎn)與45歲以下河南漢族人群肺結(jié)核發(fā)病有關(guān)，A 等位基因可能是河南漢族中青年人群肺結(jié)核發(fā)病的危險(xiǎn)因素。目前國(guó)內(nèi)外暫無SPD160 位點(diǎn)SNP 與肺結(jié)核之間相關(guān)性的報(bào)道，因此有必要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步確定SP-D160 位點(diǎn)A 等位基因與肺結(jié)核的關(guān)系。

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