GPR30下調對子宮內膜癌細胞及裸鼠移植瘤組織PI3K/AKT信號通路的影響*

雷冬梅，郭瑞霞，劉泇希，葛 新，喬玉環

1)鄭州大學第三附屬醫院病理科 鄭州450052 2)鄭州大學第一附屬醫院婦產科 鄭州450052

子宮內膜癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，其發生與雌激素密切相關［1］。G 蛋白偶聯受體30(G protein-coupled estrogen receptor 30，GPR30)是一種新型雌激素受體，可以快速與微量雌激素結合，激活細胞內第二信使，通過更快的非基因組細胞信號轉錄途徑對雌激素發生反應［2］。作者所在的課題組前期研究［3］表明，GPR30 在子宮內膜癌細胞系HEC-1A 和Ishikawa 中均有不同程度的表達。GPR30 可能通過激活PI3K/Akt 信號通路參與腫瘤的發生發展［4-5］;應用PI3K 抑制劑可以抑制子宮內膜癌細胞的增殖，促進細胞凋亡［6］。該研究觀察了下調GPR30 的表達對子宮內膜癌細胞及裸鼠移植瘤組織中PI3K/Akt 信號通路的作用，探討GPR30 用作治療子宮內膜癌新靶點的可能。

1 材料與方法

1．1 材料 人子宮內膜癌腺癌細胞系HEC-1A 和Ishikawa 由北京大學人民醫院魏麗惠教授惠贈。BALB/c 裸鼠28只(5～6 周齡，雌性，SPF 級)購自北京維通利華實驗動物技術有限責任公司，飼養于河南省實驗動物中心。兔抗人GPR30 多克隆抗體購自英國Abcam 公司，Akt 和磷酸化Akt(p-Akt)抗體購自美國Santa Cruz 公司，DMEM 培養基和胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司，免疫組化染色SP 法檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，脂質體2000 購自Invitrogen 公司，干擾質粒購自GriGene 公司。

1．2 Ishikawa 和HEC-1A 細胞中GPR30、Akt 和p-Akt 蛋白表達部位的檢測 采用免疫細胞化學SP法檢測。Ishikawa 和HEC-1A 細胞加入含體積分數10%胎牛血清的DMEM 培養基，置于37℃、體積分數5%CO2中靜置培養。取對數生長期的Ishikawa和HEC-1A 細胞用胰蛋白酶進行消化，以5 ×105/孔接種于6 孔板，鋪滿80%時終止培養，并于體積分數10%中性甲醛中固定10 min，封閉孵育30 min 后滴加一抗(GPR30、Akt 和p-Akt 抗體均按1∶1 000稀釋)孵育，4℃過夜，滴加二抗，DAB 顯色后蘇木素復染。以PBS 代替一抗作為陰性對照。結果判定標準:細胞膜、細胞質或細胞核內存在清晰的棕黃色顆粒者判定為陽性表達。

1．3 GPR30 表達下調后Ishikawa 和HEC-1A 細胞中GPR30 及p-Akt 蛋白表達水平的變化 將pGFP-V-RS(對照)或pGFP-V-RS-GPR30(干擾)分別用脂質體2000 轉染Ishikawa 和HEC-1A 細胞，傳代擴大培養，加入潮霉素篩選穩定細胞株。取對數生長期的穩定轉染細胞，應用蛋白印跡法檢測。離心收集細胞，加入適量苯甲基磺酰氟和細胞裂解液，冰上裂解，離心后取上清。制膠、上樣、電泳、轉膜、洗膜。一抗均按1∶1 000 稀釋;二抗按1∶5 000 稀釋。最后曝光并掃描各蛋白條帶，具體操作見文獻［4］。以p-Akt 與Akt 蛋白條帶灰度值的比值表示p-Akt 蛋白的相對表達水平;以GPR30 與β-actin 蛋白條帶灰度值的比值表示GPR30 蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1．4 裸鼠移植瘤組織中p-Akt 蛋白表達的變化28只裸鼠適應喂養3 d，分4組，每組7只。收集對數生長期的干擾組和對照組的Ishikawa 和HEC-1A細胞，接種于BALB/c 裸鼠右背部皮下，1 周左右可觸及腫瘤小結節，當移植瘤生長至直徑15～20 mm時，處死裸鼠，取部分腫瘤組織，用體積分數10%中性甲醛固定、切片。通過脫蠟、抗原修復后，加入血清封閉，分別添加p-Akt 一抗(按1∶1 000 稀釋)、二抗(按1∶5 000 稀釋)，PBS 沖洗，滴加SP，加顯色劑、復染、脫水、封片。以PBS 代替一抗作為陰性對照。結果判定標準:細胞質內有清晰的棕黃色顆粒者判定為陽性表達。

1．5 統計學處理 應用SPSS 17．0 處理數據，經方差齊性檢驗后，行兩獨立樣本的t 檢驗分析對照組和干擾組兩種細胞中GPR30 和p-Akt 蛋白表達水平的差異，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 Ishikawa 和HEC-1A 細胞中GPR30、Akt 和p-Akt 蛋白的表達部位 免疫細胞化學SP 法結果顯示，Ishikawa 和HEC-1A 細胞中GPR30、Akt、p-Akt蛋白均在細胞質表達，呈棕黃色染色。見圖1。

2．2 GPR30 表達下調后Ishikawa 和HEC-1A 細胞中p-Akt 及GPR30 蛋白表達水平的變化 結果見圖2，表1、2。

2．3 裸鼠移植瘤組織中p-Akt 蛋白的表達 免疫組化結果(圖3)顯示，接種對照組腫瘤細胞的裸鼠移植瘤組織中p-Akt 的表達強于接種干擾組腫瘤細胞的裸鼠移植瘤組織。

圖1 HEC-1A 和Ishikawa 細胞中2種蛋白的表達(SP，×200)

圖2 Ishikawa 和HEC-1A細胞中GPR30 及p-Akt 蛋白的表達水平

表1 Ishikawa 細胞中GPR30、p-Akt 蛋白的表達水平

表2 HEC-1A 細胞中GPR30、p-Akt 蛋白的表達水平

圖3 裸鼠移植瘤組織中p-Akt 蛋白的表達(SP，×200)

3 討論

GPR30 基因位于7p22．3，并廣泛表達于心臟、腦、淋巴、卵巢、乳腺、子宮、肝臟、腎臟等［7］組織中。有關GPR30 的表達和定位一直存在爭議，以往多認為GPR30 存在于細胞膜上。該研究結果顯示，GPR30 蛋白在子宮內膜癌細胞Ishikawa 和HEC-1A中定位于胞質，這一結果與Revankar 等［8-9］用免疫組化和熒光標記等方法發現的GPR30 定位于內質網的結果一致。

Akt 是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，Akt 活化需要蘇氨酸磷酸化位點和絲氨酸磷酸化位點的磷酸化［10］。Akt 異常活化對腫瘤的發生發展起著重要的作用。雌激素與其受體結合后可通過“基因轉錄效應”發揮作用，也可以通過快速的“非基因轉錄效應”發揮作用。近年來，部分學者［11］開始重視信號通路和子宮內膜癌的關系。Revankar 等［8］發現在雌激素核受體表達缺失且GPR30 表達陽性的乳癌細胞中，雌激素可通過GPR30 激活PI3K/Akt 信號通路，從而促進乳癌細胞的增殖。前期研究［12］顯示，17β-E2處理后Ishikawa 和HEC-1A細胞中PI3K/Akt 的信號通路被激活。該研究通過轉染下調GPR30 蛋白的表達，觀察Ishikawa 和HEC-1A 細胞中GPR30 和p-Akt 蛋白表達的變化。結果顯示，p-Akt 表達下降，說明兩種細胞PI3K/Akt 信號通路的活化均受到抑制。此外，接種干擾組兩種腫瘤細胞的裸鼠移植瘤組織中p-Akt 蛋白的表達均較接種對照組腫瘤細胞的裸鼠移植瘤組織減弱，與體外細胞實驗結果一致，提示下調GPR30 蛋白的表達可能會抑制PI3K/Akt 信號通路的活化。

綜上所述，下調GPR30 的表達可能抑制了PI3K/Akt 信號通路的活化，為GPR30 成為治療子宮內膜癌的新靶點提供了參考和依據。

［1］郭瑞霞，王建六，趙丹，等．子宮內膜癌細胞系Ishikawa和HEC-1A 細胞雌激素受體表達［J］．中國婦產科臨床雜志，2005，6(4):272

［2］張燕彩，郭瑞霞，葛新，等．GPER 在雌激素激活的子宮內膜癌細胞內PI3K/Akt 信號通路中的作用［J］．中華婦產科雜志，2012，47(4):292

［3］郭瑞霞，郭會敏，苑中甫，等．G 蛋白偶聯受體30 和磷酸化AKT 在子宮內膜腺癌中表達及意義［J］．現代婦產科進展，2009，18(12):881

［4］葛新．G 蛋白偶聯雌激素受體介導子宮內膜癌細胞雌激素的非轉錄效應的研究［D］．鄭州:鄭州大學，2013．

［5］張燕彩．GPER 在子宮內膜癌細胞雌激素激活PI3K/Akt信號傳導通路中的作用［D］．鄭州:鄭州大學，2012．

［6］郭瑞霞，喬玉環，魏麗惠，等．磷脂酰肌醇3 激酶抑制劑對17β-雌二醇作用下Ishikawa、HEC-1A 細胞增殖和凋亡的影響［J］．鄭州大學學報:醫學版，2007，42(2):322

［7］Li Y，Birnbaumer L，Teng CT．Regulation of ERRalpha gene expression by estrogen receptor agonists and antagonists in SKBR3 breast cancer cells:differential molecular mechanisms mediated by g protein-coupled receptor GPR30/GPER-1［J］．Mol Endocrinol，2010，24(5):969

［8］Revankar CM，Cimino DF，Sklar LA，et al．A transmembrane intracellular estrogen receptor mediates rapid cell signaling［J］．Science，2005，307(5715):1625

［9］Revankar CM，Mitchell HD，Field AS，et al．Synthetic estrogen derivatives demonstrate the functionality of intracellular GPR30［J］．ACS Chem Biol，2007，2(8):536

［10］Cantley LC．The phosphoinositide 3-kinase pathway［J］．Science，2002，296(5573):1655

［11］喬玉環，侯藝芳，郭瑞霞，等．人子宮內膜癌組織中磷酸化細胞外信號調節激酶的檢測［J］．鄭州大學學報:醫學版，2008，43(2):273

［12］Guo RX，Wei LH，Tu Z，et al．17 beta-estradiol activates PI3K/Akt signaling pathway by estrogen receptor(ER)-dependent and ER-independent mechanisms in endometrial cancer cells［J］．J Steroid Biochem Mol Biol，2006，9(1):9