紫杉醇酯質體不同條件下溶解效果的觀察

劉東璐，黃戰平

紫杉醇是從短葉紅豆杉樹皮中提取的天然產物，含氧四環紫杉烷環及酯側鏈是抗腫瘤的有效成分，通過與細胞微管蛋白結合，使微管聚合抑制其解聚，使細胞有絲分裂受阻斷，從而抑制腫瘤生長。臨床主要用于乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌，聯合用藥時對小細胞肺癌、肝癌、胃癌也有明顯活性［1］。盡管紫杉醇具有良好的抗腫瘤活性，但在水中溶解度僅＜0． 03 mg／mL，幾乎不溶解于水，給靜脈給藥帶來很大困難。有文獻報道，紫杉醇在甲醇、乙醇、二甲亞砜等有機溶劑中可溶解［2］，但注射劑中表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油會引起過敏及心臟、神經、腎損害、血管毒性等不良反應［3，4］。新藥物轉運系統酯質體自20世紀90年代在國內研發紫杉醇，不僅解決了水溶性問題，又提高了藥物靶向性和減輕變態反應，發揮抗腫瘤活性。但酯質體本身存在較高的藥物泄漏率、穩定性差、長期保存困難等缺點，尤其國內注射用紫杉醇酯質體，應用時按要求加5%葡萄糖溶液10mL在漩渦專用電子振蕩器上振蕩5min，致完全溶解轉移液體可為病人靜脈輸注。但經多次臨床觀察，此方式配制的液體輸注中多次發現分層、顆粒物聚集或沉淀等現象，繼而棄之造成藥物浪費。經分析：由于目前該藥多為凍干塊狀物，加入溶媒葡萄糖時，葡萄糖黏度大，溶解時藥物再分散性較差，很難在較短時間內得到均勻一致的藥物混懸液；且因包封劑型，溶解時溶劑量過少，長時間振蕩也不能完全溶解，甚至破壞包封效果致藥物泄露，而溶劑量過多振蕩時藥液會從穿刺針眼處外溢造成污染；此外，藥物在水溶液中多以混懸液形式存在，不透明，難以肉眼辨清藥物顆粒的完全溶解情況，且在目前多數醫院未實行集中配制，配藥人員多無藥學背景，操作者水平參差不齊，常誤將一些未完全溶解的藥物顆粒加入輸液中導致成品液體不穩定。本研究為保證病人用藥安全，結合說明書的配制要求和臨床使用中的問題，進行配制過程中新的藥物溶解劑量和振蕩時間的實驗研究，擬為臨床合理配制提供依據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 藥品與溶劑 注射用紫杉醇酯質體150支（30 mg／支，南京思科藥業公司生產，批號為114040309；5%葡萄糖500mL（石家莊四藥生產，批號為1311261603－A）；重蒸餾水；磷酸緩沖液（PBS）；0．9%氯化鈉溶液。

1．1．2 儀器與器材 LabAlliance高效液相色譜儀1臺（安捷倫液相色譜科技公司生產），Mastersizer 2000－激光粒子測定儀1臺（英國馬爾文公司生產），20mL、1 mL一次性注射器（山東威高醫用有限公司生產），玻璃試管數個，漩渦電子振蕩器3臺（頻率 3000r／min，振幅：X軸方向7cm，Y軸方向7cm，Z軸方向4cm，揚州寶軍電子機械有限公司生產）。

1．2 方法

1．2．1 配藥環境 均在靜脈配制中心百級生物安全柜內配制，護士帶帽子、口罩、無粉手套及防護服，嚴格執行無菌技術，溶媒液體中的微粒數符合2010版中國藥典控制指標。

1．2．2 分組 首先將注射用紫杉醇酯質體150支進行編號并分為3組，每組50支。

1．2．3 配伍溶液制備 在相同環境、溫度下，由動作規范、操作熟練的同一護士配制藥物。各藥瓶啟蓋消毒后用20mL注射器抽取5%葡萄糖溶液沿小瓶內貼壁緩慢注入，回抽空氣5mL。A組每瓶注入10mL，B組注入15mL，C組注入20mL，同時放在3個專用電子振蕩器上震蕩并計時，計時從液體瓶放到振蕩器振蕩之時開始，分別振蕩5min、10min、15min、20min時取出，靜止5min。

1．2．4 藥物穩定性檢驗方法

1．2．4．1 藥物粒徑測定 用1mL注射器抽取制備后的紫杉醇酯質體混懸液1．0mL，分別注入備用的玻璃試管中，以水為分散介質，稀釋約20倍后，用激光粒度測定儀測定每支玻璃試管溶液中不同大小直徑的藥物微粒數，由此得出一次實驗結果，以上法每個時點平行測定50次（n＝50，即每次測定都是同一批號溶媒和藥物），得出3組藥物在不同振蕩時間點藥液中不同粒徑微粒數目。

1．2．4．2 藥物包封率測定 利用含藥酯質體破乳溶液進行穩定性考察，用1mL注射器抽取紫杉醇酯質體混懸液1mL于葡聚糖凝膠（SephadexG－50）柱分離，先用30mL磷酸緩沖液洗脫液進行洗脫，取前15 mL洗脫液測定紫杉醇含量為包封藥物總量，再用0．9%氯化鈉溶液10mL洗脫剩余游離藥物。另取紫杉醇酯質體混懸液1mL，測定其中紫杉醇含量為包封和未包封藥物總量。包封率按以下公式計算：包封率（%）＝脂質體中包封的藥物／總藥物量×100%。

1．2．5 評價標準 酯質體是一個發展中的新劑型，其質量評定標準尚在逐步完善之中，《中國藥典》2000年版（二部）增加了對酯質體制劑的指導原則，包括有害有機溶劑限度檢查，形態、粒徑及其分布檢查，載藥量或包封率的檢查等［5］。《中國藥典》自2005年版起附錄中注射劑不溶性微粒檢查方法中均新增加了光阻法，并注明本方法適用于混懸液和易析出微粒的注射劑，如乳狀液、膠體溶液等。與顯微鏡計數法比較，光阻法具有操作簡便、直接檢查、快速得出結果等優點。本研究采用激光粒度測定儀光阻法測定各組每毫升混懸液中紫杉醇酯質體不同粒徑數。同時，包封率是評價酯質體制劑質量好壞最重要指標，也是酯質體能否發揮較普通制劑高效、低毒特點的關鍵，測定包封率關鍵是把未包封游離藥物從脂質體上分離出來，常用分離方法有柱層析法、透析法、超速離心法、超濾膜過濾法等［6－8］。《中國藥典》2005年版（二部）附錄微囊、微球及酯質體制劑指導原則中質量檢查項目規定：若得到的是分散在液體介質中的微囊、微球、脂質體，應通過適當方法（如凝膠柱色譜法、離心法或透析法）進行分離后測定，按下式計算包封率［包封率（%）＝（系統中包封與未包封的總藥量－液體介質中未包封的藥量）／系統中包封與未包封的總藥量×100%］，包封率不得小于80%［9］。因此，本研究利用含藥酯質體破乳溶液采用凝膠柱色譜法計算各組每毫升混懸液中紫杉醇酯質體藥物包封率。

1．2．6 統計學方法 數據用SPSS13．0軟件包進行統計學處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析，組間比較用F檢驗，以P＜0．05為差異具有統計學意義。

2 結果（見表1、表2）

表1 不同振搖時間對紫杉醇脂質體粒徑的影響（±s） nm

表1 不同振搖時間對紫杉醇脂質體粒徑的影響（±s） nm

5min 10min 15min 20min A組 50 979．16±11．25 958．25±10．78 921．17±10．23 9組別 支數0． 011）與 A組、C組比較，P＜0．01；2）與本組5min、10min比較，P＜0．01。20．13±10．08 B組 50 853．25±10．161） 821．03±10．031） 803．11±9．051）2） 802．79±9．031）2）C組 50 963．12±11．21 948．21±10．33 917．11±10．01 909．13±10．02 P＜0．01 ＜0．01 ＜0．01 ＜

表2 不同振搖時間對紫杉醇酯質體包封率的影響（±s） %

表2 不同振搖時間對紫杉醇酯質體包封率的影響（±s） %

5min 10min 15min 20min A組 50 98．29±0．13 96．25±0．09 94．37±0．07 82．02±0．011）組別 例數0． 011）與本組5min、10min、15min比較，P＜0．01。B組 50 99．87±0．25 98．93±0．23 96．22±0．19 83．63±0．071）C組 50 99．12±1．21 98．21±1．33 96．89±1．01 84．13±1．021）P＜0．01 ＜0．01 ＜0．01 ＜

3 討論

作為類脂雙分子層、結構類似生物膜藥物載體酯質體，具有使藥物緩控釋、降低不良反應、提高治療效果靶向性等優點，載入藥物后不僅提高藥物穩定性，又解決了難溶性藥物的給藥問題。但酯質體膜結構——磷脂分子間是靠范德華力、氫鍵、疏水等而相互作用，在外界不穩定因素作用下磷脂分子間不斷交換位置，可自發聚集、沉淀造成形態、結構不穩定，尤其注射用紫杉醇酯質體以凍干形式存在雖有較好穩定性［10］，但對其混懸液而言，更易受緩沖液pH值、離子強度、溫度及脂質體類脂表面電荷、粒徑等因素影響而破壞膜結構［11］，溶解時不合理的溶解分散會破壞膜結構，使脂質體顆粒發生聚集、降解、變性、沉降等不穩定現象，且其粒徑大小和粒度分布均勻程度也會直接影響藥物在機體組織內的作用［12］。因此，制備紫杉醇酯質體成品輸液時，應嚴格控制藥物脂質體粒徑和包封率大小，使其盡量符合國家藥典規定指標，保證藥效［13］。本研究針對該藥緩沖液溶媒葡萄糖黏度大，溶解時使粉劑再分散性較差，很難在較短時間內得到均勻一致酯質體混懸液，溶解時常借助專用電子振蕩器經一定振蕩時間振搖助溶而完全溶解。由于藥物酯質體塊狀物在不同劑量溶媒中溶解分散時，劑量不同、振蕩時間不同振搖時使藥物顆粒表面所受外力會不同，從而影響藥物溶解效果。在此理論基礎上結合臨床觀察多次發現成品液體不穩定現象，進一步展開該藥配制時溶解劑量和振蕩時間實驗研究，為合理用藥提供依據。

3．1 溶媒劑量的影響 本研究以說明書加入溶媒劑量10mL和實際觀察該藥瓶最大溶媒劑量為22mL為參考，觀察3種不同劑量。結果顯示：不同溶媒劑量下該藥物經不同振搖時間制得藥物混懸液，采用激光粒度儀測定藥物粒徑，在其他條件相同情況下通過50個批次平行考察發現，不同溶媒劑量對混懸液中藥物粒徑有明顯影響。B組采用15mL溶媒劑量制備藥物混懸液，不同振搖時間藥物粒徑較A組、C組小，說明了Stokes方程酯質體粒徑越小越穩定的研究。經分析：該藥物在10mL溶媒劑量時借助漩渦專用電子振蕩器最大振幅7mm，振蕩頻率 3000r／min振搖助溶下，由于溶媒量少，藥物塊狀物在一定溶液中分散空間小不宜分散；20mL溶媒量時由于該藥瓶的最大容積為22mL，溶媒加入后，藥瓶中空余空間小，振搖時溶媒與瓶體一起旋轉，甚至不存在相對旋轉，藥物顆粒表面受外作用力小，形成藥物顆粒與顆粒、顆粒與溶媒間相互結合力相對較大，不易使顆粒分散，故而形成較大粒徑酯質體顆粒，導致成品液體中顆粒物聚集、沉淀或分層不穩定性現象。而加入15mL溶媒振搖時藥物塊狀物在溶媒中，隨振蕩器擺動自由運動，在相同振搖時間下藥物顆粒較易分散，顆粒粒徑較小致完全溶解，呈均勻分布不易引起聚集、沉淀或分層等不穩定現象。因此，紫杉醇酯質體藥物在水溶液中振搖溶解時應加入15mL溶劑量，其物理穩定性指標才更可靠。

3．2 振搖時間的影響 包封率是評價酯質體制劑質量最重要指標，也是酯質體能否發揮較普通制劑高效、低毒特點的關鍵。《中國藥典》2005版質量檢查指導原則中規定：包繞后的未溶解藥物脂質體粒徑在300 nm以下，而分散在液體介質中酯質體，包封率不得小于80%［9］。由于藥物酯質體本身包封劑型特點，在一定量液體介質中借助振蕩器一定的震蕩幅度和頻率分散時，其分散效果也與振蕩時間密切相關。本研究參照說明書中振搖時間為5min和肉眼觀察藥物完全溶解所需振搖時間為20min為參考，嚴密觀察分別在振搖5min、10min、15min、20min時混懸液中藥物粒徑和包封率的變化。結果顯示：B組溶媒劑量下當振搖時間從5min增加到20min時，藥物粒徑從853．25 nm減少到了802．79nm，可見隨著振搖時間的延長混懸液中藥物粒徑會逐漸減小。在振搖15min與20 min時粒徑變化不大，但15min與5min、10min兩個時間點粒徑比較差異有統計學意義（P＜0．01），因此應振搖15min。表2結果顯示：不同溶媒劑量下該藥物經不同振搖時間制得混懸液，采用高效液相色譜儀測定藥物包封率，在其他條件相同情況下通過50個批次平行考察發現，不同振蕩時間對混懸液中藥物包封率有明顯影響。首先3組不同劑量下隨著振蕩時間延長藥物包封率均在80%以上，符合國家藥典規定要求。其次，3組隨著振蕩時間延長藥物包封率均降低，特別是當振搖增加到20min時有明顯下降，與其他各時間點相比差異統計學意義（P＜0．01），因此不應過分延長振蕩時間。經分析：制備紫杉醇酯質體成品輸液時，在專用振蕩器振搖助溶下，顆粒在一定時間內經過X軸、Y軸、Z軸方向形成漩渦式同方向分散，顆粒與顆粒間碰撞力、顆粒與溶媒間剪切力保持同向，不易破壞顆粒表面間穩定作用力，使顆粒表面雙層膜保證完整，使紫杉醇不易外滲提高了包封率，但振搖時間延長可能會破壞顆粒表面間穩定作用力，使顆粒表面雙層膜破壞，使包封率下降。因此振蕩時間不應大于15 min。結果顯示，15min振蕩時間藥液中粒徑最小，藥液最穩定，因此綜合分析更應以15min為最佳振蕩時間。

總之，針對目前脂質體作為紫杉醇水溶性藥物的新型載體，由于脂質體本身和該藥包繞劑型特點，使紫杉醇酯質體凍干塊狀物在水溶液中通過振蕩溶解制備成品輸液時，易受溶媒量和震蕩時間等因素影響而使藥物溶解不全或破壞膜完整性，導致脂質體聚集、沉降、藥物滲漏和分層。本研究針對該藥目前形式配制下臨床應用中成品輸液的不穩定現象，考察了在注入10mL、15mL、20mL 3種不同溶媒劑量下，分別在振搖5min、10min、15min、20min以包封率、粒徑2個重要特征為評價指標，分析藥物脂質體混懸液中經專用振蕩器振蕩溶解下的穩定性變化。結果配制該藥物時應注入15mL溶媒，振搖15min混懸液中藥物穩定性指標最可靠。由此充分了解該藥的溶解與溶劑量的配比關系和恰當振搖時間，有助于減少藥物不良事件的發生，提高用藥安全性。

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