周圍神經端側縫合后再生軸突PSA-NCAM的表達及對趨化性的影響

虞　慶　蔣良福　丁　健　李志杰　王安遠　陳一衡　李　士　林　康

溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院手外科，浙江溫州325000

周圍神經端側縫合后再生軸突PSA-NCAM的表達及對趨化性的影響

虞慶蔣良福丁健李志杰王安遠陳一衡李士林康

溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院手外科，浙江溫州325000

目的觀察端側縫合后再生軸突表面唾液酸-神經細胞黏附分子（polysialic acid-neural cell adhesion molecule，PSA-NCAM）分子的表達，及其對趨化性的影響。方法雌性清潔級SD大鼠24只，分4組，正常對照組、端側縫合組、電刺激組和PSA拮抗劑組。3個月后進行電生理檢測，免疫組化檢測再生軸突PSA-NCAM表達，肌肉組織學檢測，神經元逆行熒光示蹤觀察運動神經元比例。結果正常組不表達PSA-NCAM，電刺激組明顯高于端側組（P＜0．05)，拮抗劑組與端側組無顯著差異。端側組運動神經元比例為16．54%，短暫電刺激后運動神經元比例上升至29．25%（P＜0．05）。拮抗劑組運動神經元比例與端側組無顯著差異。結論端側縫合再生的神經趨化性與再生軸突表面PSA-NCAM表達量相關，提高軸突PSA-NCAM的表達有助于改善再生神經的趨化性。

周圍神經；神經再生；端側縫合；唾液酸-神經細胞黏附分子

周圍神經端側縫合指將斷離的周圍神經的遠側斷端，縫接在附近完整神經干的側面，為神經修復提供了新的方法。我們在前期工作中證實了端側縫合能有效促進神經再生[1,2]，同時發現再生神經在趨化性方面表現不明顯。我們推測是由于側方出芽時的新生軸突缺少引導特異性生長的識別分子。唾液酸-神經細胞黏附分子（polysialic acid-neural cell adhesion molecule，PSA-NCAM)是近年來發現的神經識別分子，在運動神經發育、損傷神經肌肉再支配中起到重要作用[3]。本研究將觀察端側縫合后再生軸突表面PSA-NCAM分子的表達及其對趨化性的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物

2013年9～12月間選取由溫州醫科大學SPF動物實驗中心提供的健康雌性SD大鼠24只作為研究對象，均為體重230～250 g的健康清潔級大鼠。將上述大鼠置于室溫18℃～22℃、濕度60%～70%、通風良好的同一清潔飼養室內進行飼養。

1.2實驗方法

將24只小鼠隨機分為四組：正常組（n=6）、實驗組[端側縫合組（n=6）、電刺激組（n=6）和PSA拮抗劑組（n=6）]。①端側縫合組SD大鼠應用1%戊巴比妥鈉（5 mg/100 g）腹腔麻醉后，固定，局部消毒，脫毛，沿上臂縱軸切開皮膚，顯露深部肌皮神經，在肌皮神經根部切斷。顯露尺神經，用顯微鑷在其內后方撕開1 mm長的外膜，10倍顯微鏡下將肌皮神經與尺神經用“11-0”縫線作端側縫合。②電刺激組在同樣操作后，縫合口近端尺神經予短暫電刺激（20 Hz，1 h，意大利ESAOT公司的Reporter四道程肌電誘發電位儀）。③PSA拮抗劑組在神經端側縫合并進行短暫電刺激后，縫合口局部應用PSA-NCAM的拮抗劑0．5 μL Endoneuraminidase-N（8．7 U/μL，上海，博奧派克生物）。④正常組顯露肌皮和尺神經后，重新縫合關閉傷口。

1.3觀察指標

各組大鼠飼養3個月后，重新麻醉，固定，進行電生理及組織學檢測。

1．3．1電生理檢測使用意大利ESAOT公司的Reporter四道程肌電誘發電位儀記錄肱二頭肌肌電圖。在同一位置將刺激電極置于肌皮神經下方，肱二頭肌肌腹飽滿出插入同心針記錄電極。使用3．20 mA的電流強度，0．5 ms的電流脈寬，刺激頻率為2 Hz。

1．3．2檢測再生軸突PSA-NCAM表達情況顯露神經縫合處，正常組距肌皮神經根部5 mm，實驗組距縫合點遠端5 mm處取肌皮神經，均長約3 mm。常規給予10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片后采用免疫組化SP法，嚴格按照說明書中的操作步驟進行操作。采用美國IPP6．0專業圖像分析軟件對PSA-NCAM免疫組化結果中的光密度值進行測定。

1．3．3肌肉組織學檢測將肱二頭肌經10%甲醛固定，酒精脫水，石蠟包埋。在肌腹中部同樣水平橫向切片，厚5 pan，HE染色，LeicaDWLB2型顯微鏡觀察，Leica FW4000圖像分析軟件測量肱二頭肌肌纖維截面積。

1．3．4神經元逆行熒光示蹤顯露臂叢神經束支部，放大10倍顯微鏡下用1 μL微量注射器于實驗組肌皮神經外膜下注射1 μL 3%Fluoro-Gold水溶液（Sigma公司，美國）。FG熒光染色3 d后，動物重新麻醉、固定后，通過心臟灌注多聚甲醛液體，背側入路顯露脊髓，完整切取頸5到胸1節段脊髓及背根神經節，固定并脫水后，行連續冰凍切片（Leica冰凍切片機，德國），用熒光顯微鏡（LeicaDWLB2型，德國）觀察，熒光濾鏡激發波長為330～380 nm，在這個激發波下神經元胞漿肉的Fluoro-Gold顯示黃白色熒光（波長440 nm）。通過圖像處理系統計數各組的前角運動神經元及背根感覺神經元。

1.4統計學處理

采用Stata 7．0統計學分析軟件進行統計處理，設定可信水平95%。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，各組差異采用方差分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1電生理檢測

端側組肱二頭肌CMAP最大波幅為正常對照組的28．59%，電刺激組為端側組的2．24倍，經單因素方差分析各組差異有統計學意義（F=19．53，P＜0．01）。端側組肱二頭肌CMAP潛伏期較正常組減慢86．46%，電刺激組為端側組的69．27%，經單因素方差分析各組差異有統計學意義（F=70．47，P＜0．01），見表1。

表1　肱二頭肌CMAP最大波幅與潛伏期（x±s，n=6）

2.2各組PSA-NCAM的表達

對各組由免疫組化測得的光密度值進行比較，正常組不表達PSA-NCAM，經單因素方差分析各組差異有統計學意義（F=95．69，P＜0．01），見表2。

2.3肌肉組織學檢測

端側組肱二頭肌纖維橫截面積為正常組的82．97%，經單因素方差分析各組差異有統計學意義（F=4．78，P＜0．05），見表2。

表2　各組神經PSA-NCAM的表達（光密度值）和肱二頭肌纖維截面積（x±s，n=6）

2.4實驗組神經元逆行熒光示蹤

電刺激組運動神經元數目增加，經單因素方差分析各組差異有統計學意義（F=78．87，P＜0．01）。各組感覺神經元差異無統計學意義（F=0．14，P＞0．05）。神經元總數差異有統計學意義（F=13．9，P＜0．01），見表3。在各組運動神經元數目中，端側組運動神經元比例為16．54%，電刺激組運動神經元比例上升至29．25%，拮抗劑組運動神經元比例減至18．21%。

表3　實驗組運動神經元數目及比例（x±s，n=6）

3　討論

周圍神經端側縫合為我們提供了神經長段缺損修復的新方法，是指將斷離的周圍神經的遠側斷端，縫接在附近完整神經干的側面。與傳統神經端端縫合比較具有的優點包括：①對供體神經影響很小；②縮短神經再生時間，可以選擇距損傷神經靶器官較近的完整神經作為供體神經；③操作簡便。

大量實驗研究證實了周圍神經端側縫合的有效性[4,5]，但是臨床報道各家不一。Millesi等[6]報告9例臂叢上干損傷應用膈神經、副神經、肩胛背神經以端側方法分別移位至胸前內側神經、肩胛上神經及腋神經，結果8例相應肌力恢復達M3以上，僅1例肌力恢復為M2。而Pienaar等[7]報道10例患者，16個月后運動感覺均無明顯恢復。因此有必要進一步研究周圍神經端側縫合后神經再生規律，從而提高功能恢復效果。

周圍神經損傷后功能恢復的關鍵因素是再生神經纖維能否特異性地長入對應的靶器官，Hoke等[8]發現運動神經纖維再生軸突有傾向性地長入運動神經到達肌組織而非皮膚，此即傾向性運動神經再支配（preferential motor reinnervation，PMR）現象。神經趨化性是解決周圍神經再生后選擇性再生的希望和關鍵。目前認為影響周圍神經趨化性的因素包括[9]：①遠端的神經纖維通道；②靶器官分泌的神經營養因子；③近端的神經元胞體。

PSA-NCAM是一類介導黏附的膜表面糖蛋白，主要存在于胚胎發育期，在神經元發育中起重要作用，可能與突觸的重排和可塑性有關。在成年期，PSANCAM的表達限制在保留可塑性的區域。現已證明PSA-NCAM介導的作用能導致細胞內級聯信號系統的激活，對神經細胞的生長分化、軸突出芽、突觸修飾和神經信號傳遞都發揮了重要作用，同時在運動神經發育、損傷神經肌肉再支配中起到重要作用。Franz等[10]研究表明，損傷后再生的運動神經軸突表面PSA-NCAM呈高表達，同時PSA-NCAM的高表達對再生神經趨化性是必須的。

我們研究小組在前期工作中發現神經端側縫合后再生神經趨化性不明顯[1,2]。本研究中我們發現周圍神經端側縫合后再生軸突表面表達PSA-NCAM，短暫電刺激能顯著提高PSA-NCAM的表達，同時短暫電刺激能提高端側縫合再生神經趨化性，局部應用PSA拮抗劑后再生神經趨化性下降。這些結果初步表明端側縫合再生的神經趨化性與軸突表面PSA-NCAM的表達相關，提高軸突PSA-NCAM的表達有助于改善再生神經的趨化性。

綜上所述，周圍神經損傷是臨床常見疾病，不僅給患者帶來了巨大的痛苦，也給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。我們的研究將進一步揭示周圍神經端側縫合后神經再生的規律，為臨床提高周圍神經修復效果提供新的途徑。

[1]虞慶，王濤，顧玉東.神經端側縫合后趨化性的神經元逆行示蹤研究[J].中華顯微外科雜志，2009，32（1）：36-38.

[2]虞慶，王濤，羅鵬波，等.周圍神經端側縫合后神經再生及其趨化性的實驗研究[J].中華手外科雜志，2007，23（1）：30-33.

[3]Soundararajan P，Miles GB，Rubin L L，et al.Motoneurons derived from embryonic stem cells express transcription factors and develop phenotypes characteristic of medial motor column neurons[J].J Neurosci，2006，26（12）：3256-3268.

[4]Haastert K，Joswig H，Jaschke KA，et al.Nerve repair by end-to-side nerve coaptation：Histologic and morphometric evaluation of axonal origin in a rat sciatic nerve model[J]. Neurosurgery，2010，66（3）：567-576.

[5]Silva DN，Coelho J，Frazilio FO，et al.End-to-side nerve repair using fibrin glue in rats[J].Acta Cir Bras，2010，25（2）：158-162.

[6]Millesi H，Schmidhammer R.Nerve fiber transfer by endto-side coaptation[J].Hand Clin，2008，24（4）：461-483.

[7]Pienaar C，Swan MC，De Jager W，et al.Clinical experience with end-to-side nerve transfer[J].J Hand Surg Br，2004，29（5）：438-443.

[8]Hoke A，Brushart T.Introduction to special issue：Challenges and opportunities for regeneration in the peripheral nervous system[J].Exp Neurol，2010，223（1）：1-4.

[9]Madison RD，Robinson GA，Chadaram SR.The specificity of motor neurone regeneration（preferential reinnervation）[J]. Acta Physiol（Oxf），2007，189（2）：201-206.

[10]Franz CK，Rutishauser U，Rafuse VF.Polysialylated neural cell adhesion molecule is necessary for selective targeting of regenerating motor neurons[J].J Neurosci，2005，25（8）：2081-2091.

PSA-NCAM expression of peripheral nerve regeneration axon after endto-side neurorrhaphy and the influence on chemotaxis

YU QingJIANG LiangfuDING JianLI ZhijieWANG AnyuanCHEN YihengLI ShiLIN Kang
Department of Orthopaedics,the Second Affiliated Hospital&Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou325000,China

Objective To examine the expression of PSA-NCAM and neurotropism after end-to-side neurorrhaphy．Methods A total of 24 female Sprague-Dawley rats were divided into 4 groups,normal group,end-to-side neurorrhaphy group,electrical stimulation group and PSA antagonist group．Post operation,electrophysiology,histology of the muscle,PSA-NCAM stain and retrograde Fluoro-Gold neuron tracing after three months were conducted．Results Normal group did not express PSA-NCAM,it showed that in the electrical stimulation group,PSA-NCAM was higher than end-to-side group(P＜0．05),antagonists and end-to-side group had no significant difference．Retrograde neuron tracing demonstrated that motor neuron counts in electrical stimulation group was 29．25%,higher than end-to-side group (16．54%,P＜0．05)．Motor neuron proportion in antagonist group and end-to-side group had no significant difference．Conclusion Neurotropism after end-to-side neurorrhaphy is related with PSA-NCAM expression．Therapeutics aimed at increasing PSA-NCAM levels on regenerating motor axons may lead to superior funtional outcomes．

Peripheral nerves;Nerve regeneration;End-to-side neurorrhaphy;Polysialic acid-neural cell adhesion molecule

R73-3

A

1673-9701（2015）07-0014-03

浙江省自然科學基金資助項目（LY12H06005）

（2014-05-05）