脂多糖刺激臍帶間充質干細胞上調IL－1Ra分泌的研究＊

李 敏，胡 松，王 蘭，范文躍

1.成都醫學院 基礎醫學院（成都 610500）；2.成都醫學院 生物醫學系（成都 610500）

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來源于中胚層的多能干細胞，具有自我更新和多向分化能力，可向三胚層細胞分化，如骨細胞、神經元細胞、心肌細胞、脂肪細胞和胰腺細胞等［1－5］。骨髓、臍帶、脂肪組織、牙組織、羊水、外周血、和鼻甲［6－12］等機體組織均可分離培養出 MSCs。其中，以骨髓來源的MSCs最具代表性，但其培養到第6代后增殖能力減弱；而臍帶華通膠來源的臍帶MSCs（umbilical cord MSCs，UC－MSCs）自我更新及增殖能力均很強［13］。MSCs強表達CD13、CD29、CD105和 CD44，弱表達 CD106，不表達 CD14、CD34、CD11a、CD31、CD45與 HLAⅡ抗原，不表達或低表達HLAⅠ抗原。MSCs具有低免疫原性和免疫抑制特性，可抑制T細胞與B細胞增殖［14－15］，抑制樹突狀細胞與自然殺傷細胞的免疫功能［16－17］。白介素1受體拮抗劑（interleukin－1receptor antagonist，IL－1Ra）是首個被發現天然存在的細胞因子拮抗劑，競爭性結合于IL－1受體后不引起IL－1生物學效應，從而起到抗炎作用［18］。IL－1Ra和MSCs都具有抑制炎癥的作用，其共移植可改善臨床疾病的治療效果［19］。Toll樣受體（Toll－like Receptors，TLRs）是參與固有免疫的一類重要蛋白質分子，也是連接固有免疫和適應性免疫的橋梁，其能特異識別病原相關分子模式。當微生物突破機體的物理屏障時，TLRs可識別相應的配體來激活機體產生免疫應答。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是TLR4的特異性配體，LPS激活TLR4，可刺激免疫細胞分泌Ⅰ型IFNs和促炎因子，如TNF－α、IL－1β和IL－6。UC－MSCs高表達 TLR4［20］。

為探討 MSCs的免疫機制，本研究選擇UCMSCs，以IL－6為實驗的陽性對照［21－22］，采用 LPS激活TLR4，觀察UC－MSCs對IL－1Ra分泌的影響，以期更深入地了解UC－MSCs免疫抑制功能與細胞因子分泌的關系。

1 材料與方法

1.1 試劑

胎牛血清（Millipore，USA）；L－DMEM 培養基（HyClone，美國）；LPS（Peprotech，美國）；IL－1Ra和IL－6試劑盒（上海泛科實業有限公司，中國）；胰蛋白酶（上海碧云天生物技術有限公司，中國）；抗人單 克 隆 抗 體 CD14－PE、CD34－FITC、CD29－PE 和CD105－APC及其同型對照（eBiocsience，美國）；引物合成（上海生工生物工程技術服務有限公司，中國）；Trizol細胞裂解液和逆轉錄試劑盒（Takara，日本），EvaGreen Dye（Bio－Rad，美國）。

1.2 方法

1.2.1 UC－MSCs原代培養 采用組織塊法分離培養UC－MSCs：取新鮮臍帶（來源于成都醫學院第一附屬醫院產科，均取得產婦同意）置于培養皿中，用PBS沖去臍帶外圍血塊，撕去外膜，拔掉2根動脈，沿靜脈剪開，用眼科鑷撥離靜脈，剩余為華通膠。PBS沖洗掉剩余臍帶組織上的血液，將其剪為約2mm2的組織塊，裝入T75塑料培養瓶內，加入5mL培養基，48h后加入3mL培養基，每3d換液并鏡下觀察。

1.2.2 流式細胞術檢測UC－MSCs表面標志物 取胰蛋白酶消化UC－MSCs，1000rpm離心5min，以5×104個/管分裝于1.5mL離心管中，分別加入抗人單克隆抗體 CD14－PE、CD34－FITC、CD29－PE和CD105－APC及其同型對照，流式細胞儀檢測。

1.2.3 分組 設立實驗組和對照組，分別以1、10、20μg/mL LPS刺激 UC－MSCs為實驗組，未刺激UC－MSCs為對照組；采用1ug/mL LPS分別刺激UC－MSCs 3、8、24h為實驗組，未刺激UC－MSCs為對照組。

1.2.4 qPCR法檢測IL－1Ra和IL－6基因的表達

Trizol細胞裂解液裂解細胞并提取RNA，按照Takara試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。引物信息如下（表1），設置GAPDH為內參基因，采用qPCR法檢測IL－1Ra和IL－6的基因表達。10uL qPCR反應體系：cDNA 1μL，Primer 1μL，EvaGreen Dye 5μL，H2O 3μL。反應條件：95℃3min，1個循環；95℃5s，60℃10s（IL－1Ra 57℃），72℃15s，40個循環；72℃60s，1個循環。Bio－Rad qPCR儀檢測。

1.2.5 ELISA法檢測IL－1Ra和IL－6蛋白質的分泌 收集LPS不同劑量與時間刺激的細胞上清，未刺激的UC－MSCs上清為空白對照組。按照IL－1Ra和IL－6ELISA試劑盒說明書操作，檢測各組上清中IL－1Ra和IL－6蛋白質分泌量。酶標儀測定其吸光度值，繪制標準曲線，并計算各樣品的濃度值。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 5軟件對所有數據進行分析，兩兩比較采用單因素方差分析Dunnett－t檢驗，結果以均數±標準差（±s）進行描述，檢驗水準α設定為0.05。

表1 qPCR引物信息

2 結果

2.1 原代培養及鑒定

采用臍帶組織塊貼壁法原代培養第7～10天，可見組織邊緣有貼壁細胞，呈長梭形（圖1）。流式細胞術檢測UC－MSCs的標志性表面抗原，結果顯示：UC－MSCs表達CD29和CD105，不表達CD14與CD34（圖2）。根據其形狀與流式細胞術結果，分離培養的細胞符合UC－MSCs的生物學特性。

圖1 UC－MSCs原代細胞培養13d（40×）

圖2 流式細胞術檢測UC－MSCs表面標志物

2.2 LPS激活TLR4對 UC－MSCs分泌IL－1Ra和IL－6的影響

qPCR法及ELISA法檢測LPS不同劑量（1、10、20μg/mL）刺激 UC－MSCs 24h后IL－1Ra和IL－6的分泌。1μg/mL和10μg/mL實驗組較對照組IL－1Ra基因表達均增加，20μg/mL實驗組較對照組IL－1Ra基因表達下降；1μg/mL實驗組與對照組比較，IL－1Ra基因表達差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3A），而10μg/mL實驗組與對照組比較，IL－1Ra基因表達差異無統計學意義（P＞0.05）。1μg/mL和10μg/mL實驗組較對照組IL－6基因均表達增加，其差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3B）；20μg/mL實驗組IL－6基因較對照組表達下降。1μg/mL和10μg/mL實驗組較對照組IL－1Ra蛋白質分泌增加，20μg/mL實驗組較對照組IL－1Ra蛋白質分泌下降；1μg/mL實驗組與對照組比較，IL－1Ra蛋白質分泌差異有統計學意義（P＜0.01）（圖3C）；而10μg/mL實驗組與對照組比較，IL－1Ra蛋白質分泌差異無統計學意義（P＞0.05）。LPS 1μg/mL、10μg/mL和20μg/mL實驗組較對照組IL－6蛋白質分泌均增加，其差異有統計學意義（P＜0.01）（圖3D）。

qPCR法及ELISA法檢測LPS在3、8、24h刺激 UC－MSCs后IL－1Ra和IL－6表達為：3h、8h和24h實驗組較對照組IL－1Ra基因表達增加，3h、8h實驗組與對照組比較IL－1Ra基因表達差異有統計學意義（P＜0.01）（圖4A），而24h實驗組與對照組比較IL－1Ra基因表達差異無統計學意義（P＞0.05）。3h、8h和24h實驗組較對照組IL－6基因表達均增加，3h實驗組較對照組比較，IL－6基因表達差異有統計學意義（P＜0.01）（圖4B）；8h和24h實驗組與對照組比較IL－6基因表達差異無統計學意義（P＞0.05）。3h、8h和24h實驗組較對照組IL－1Ra蛋白質分泌增加，24h實驗組與對照組比較IL－1Ra蛋白質分泌差異有統計學意義（P＜0.01）（圖4C），而3h、8h實驗組與對照組比較，IL－1Ra蛋白質分泌差異無統計學意義（P＞0.05）。3h、8h和24h實驗組較對照組IL－6蛋白質分泌均增加，其差異有統計學意義（P＜0.01）（圖4D）。

圖3 LPS不同劑量刺激UC－MSCs后IL－1Ra和IL－6基因與蛋白質水平比較

圖4 LPS不同時間刺激UC－MSCs后IL－1Ra和IL－6基因與蛋白質分泌比較

3 討論

IL－1Ra對很多炎癥性疾病起到廣譜抗炎作用，且可抑制移植排斥反應的發生與發展［23］，協同MSCs的免疫抑制作用。IL－1Ra與 MSCs聯合移植，可顯著改善由氨基半乳糖誘導豬急性肝衰竭的肝功能，促進肝組織再生［19］。在大鼠爆發性肝衰竭模型中，IL－1Ra基因轉導至羊水來源的MSCs移植于大鼠中，發現其可促進肝細胞再生，緩解爆發性肝衰竭的病情［24］。IL－1Ra與VEGF基因轉導至骨髓MSCs，將其與胰腺進行共移植，發現其可改善移植的治療效果［25］。 炎癥環境可增加IL－1Ra的 分泌［26］。研究［27］發現，炎癥環境培養的 MSCs分泌的IL－1Ra比常氧環境增加了10倍。IL－1Ra作用發揮與其競爭性結合IL－1受體，阻斷IL－1信號級聯反應有關。IL－1β是引發肺水腫起主要作用的炎癥因子之一［28］，而在LPS誘導的急性肺損傷模型中，MSCs灌注可提高該疾病的生存率，該作用與MSCs分泌IL－1Ra，進而減弱IL－1β誘導的促炎活動有關［29－30］。在本研究結果顯示：LPS誘導的炎癥環境可刺激UC－MSCs分泌IL－1Ra增多。

目前，在人類體內發現有10種TLRs（TLR1～10），在小鼠身上發現有13種 TLRs（TLR1～13）［31］，均屬于IL－1受體超家族成員。MSCs表達功能性TLR4，可促進其分化［1，20］、增殖［32］和 遷移［33］。有研究發現，激活TLR4可增強 MSCs免疫抑制能力，促使MSCs向抗炎型轉變。在Sun等［34］采用LPS誘導小鼠急性肺損傷模型中，發現UCMSCs可快速遷移到炎癥部位，減輕肺組織損傷和炎癥反應，該作用與LPS刺激UC－MSCs增強CD4＋CD25＋FOX P3＋Treg細胞免疫功能和增加抑炎因子IL－10分泌，并下調促炎因子 TNF－α、MIP－2和IFN－γ表達有關。關于激活TLR4對 MSCs免疫抑制能力影響的研究尚存爭議。有研究［35－36］報道，激活TLR4使MSCs向促炎表型轉變，也有研究［37－38］報道，激活TLR4對 MSCs的免疫抑制能力并沒有影響或者使其作用減弱。本研究發現，LPS不同劑量與時間激活TLR4后，UC－MSCs均分泌IL－1Ra，在基因水平上，以1μg/mL刺激 UC－MSCs 3h和8h表達IL－1Ra差異顯著；在蛋白質水平上，則以1μg/mL刺激UC－MSCs 24h表達IL－1Ra差異顯著。由此表明，激活TLR4增加UC－MSCs對IL－1Ra的分泌，可能會增強或協同UC－MSCs的免疫抑制作用。

綜上所述，UC－MSCs免疫作用發揮可能與炎癥環境存在的炎癥介質有關，LPS激活TLR4，可刺激UC－MSCs分泌IL－1Ra增加，該作用可能與MSCs免疫調節機制有關，可能協同或增強MSCs的免疫抑制作用。但該作用對炎癥的負調控，也可能會增加機體對病原體的感染。因而，深入研究MSCs中TLR4的免疫調節機制，對MSCs臨床應用的安全性、有效性和長期性是非常有意義的。

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