喘息患兒氣道炎癥細胞檢測的臨床意義

鄧莉莉，何驍，雷曄飛，李康杰，肖啟亮

（1.湖南省郴州市第一人民醫院北院（兒童醫院）兒科，湖南 郴州 423000；2.湖南省郴州市第一人民醫院中心醫院骨科，湖南 郴州 423000；3.南華大學附屬第二醫院兒科，湖南 衡陽 421001）

喘息患兒氣道炎癥細胞檢測的臨床意義

鄧莉莉1，何驍2，雷曄飛1，李康杰2，肖啟亮3

（1.湖南省郴州市第一人民醫院北院（兒童醫院）兒科，湖南 郴州 423000；2.湖南省郴州市第一人民醫院中心醫院骨科，湖南 郴州 423000；3.南華大學附屬第二醫院兒科，湖南 衡陽 421001）

目的觀察喘息患兒痰液炎癥細胞的比例及變化，并探討其意義。方法支氣管哮喘患兒30例（哮喘組），喘息性支氣管炎患兒90例（按喘息發作次數分為喘息Ⅰ組30例和喘息Ⅱ組60例，后者按喘息從首次至末次發作的時間長短分為喘息Ⅱa組及喘息Ⅱb組各30例），同期健康體檢兒童30例（對照組），采用誘導痰技術檢測痰液嗜酸性粒細胞（Eos）、中性粒細胞（Neu）、淋巴細胞（Lym）比例。結果Eos比例：在喘息發作時，喘息各組明顯高于喘息停止后的喘息各組及對照組（P＜0.01），喘息Ⅰ組明顯低于喘息Ⅱ組（P＜0.01），喘息Ⅱa組低于喘息Ⅱb組（P＜0.01），而喘息Ⅱb組與哮喘組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；在喘息停止后，喘息Ⅰ組Eos比例迅速下降，與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），而喘息Ⅱb組Eos比例仍較高，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），與哮喘組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。Neu比例：在喘息發作時，喘息各組明顯高于喘息停止后的喘息各組及對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；在喘息停止后，喘息Ⅰ組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），喘息Ⅱ組其Neu比例仍較高，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），與哮喘組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），而喘息Ⅱa組與喘息Ⅱb組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。Lym比例：在喘息發作時，喘息各組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；在喘息停止后，喘息各組均較喘息發作時喘息各組和對照組高，差異有統計學意義（P＜0.01），喘息Ⅱ組比例高于喘息Ⅰ組（P＜0.01），與哮喘組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論結合臨床病史，動態觀察痰液炎癥細胞的比例及變化，可能會對喘息性支氣管炎發展成哮喘的早期診治有一定價值。

支氣管哮喘；喘息性支氣管炎；誘導痰；炎癥細胞

誘導痰技術在呼吸系統疾病氣道炎癥的基礎研究和臨床應用中的作用受到越來越多的重視。隨機選擇支氣管哮喘患兒30例和喘息性支氣管炎患兒90例，于喘息發作時、喘息停止后利用誘導痰技術檢測痰液炎癥細胞的比例及變化，旨在探討喘息性支氣管炎發展為哮喘的可能機制，為哮喘病早期診治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1臨床資料

隨機選擇2012年11月-2013年11月郴州市第一人民醫院北院收治的符合喘息性支氣管炎診斷標準[1]的喘息性支氣管炎患兒90例。按喘息發作次數分為喘息Ⅰ組（喘息僅發作1次者）30例，其中男15例，女15例，年齡13個月～3歲；喘息Ⅱ組（喘息發作3次或3次以上者）60例。后者按喘息從首次至末次發作的時間長短分為喘息Ⅱa組（喘息發作時間＜1年者）30例，其中男14例，女16例，年齡14個月～3歲；喘息Ⅱb組（喘息發作時間≥1年者）30例，其中男16例，女14例，年齡15個月～3歲。另選輕度支氣管哮喘患兒30例（哮喘組），其中男16例，女14例，年齡2～4歲，均符合兒童支氣管哮喘診斷標準[2]。對照組30例系同期健康體檢兒童，男14例，女16例；年齡2～3歲。以上3組在性別、年齡比較上差異無顯統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法

1.2.1痰液誘導參照歐洲呼吸協會誘導痰液指導小組的指南[3]并加以改進。對照組、觀察組急性期（入院24 h內）及臨床緩解期（臨床癥狀停止及哮鳴音消失后5 d）進行誘導痰，具體方法如下：受試者清潔口鼻后吸入200μg沙丁胺醇，用醫用面罩式超聲霧化器，直接吸入3%高滲鹽水，流量為1 L/min，誘導20～30 min，誘導過程中隨時將痰咳出，不易咳出者則由專職護師按正規操作吸痰，將痰置于干凈、無菌的帶刻度容器中。同時嚴密觀察小兒的呼吸頻率、氣喘等情況，如不能耐受或吸入高滲鹽水后30 min仍無痰液導出則立即停止操作。收集的痰液在1 h內處理，處理前置入4℃冰箱保存。

1.2.2痰液處理①選取合格痰液。挑取含黏液的痰栓，顯微鏡下觀察鱗狀上皮細胞小于5%并可見肺巨噬細胞時認為是合格[4]。②將痰液稱重，加入4倍痰量0.1%的二硫蘇糖醇，在旋渦式混合器上混勻。③置于37℃恒溫水育箱孵育15 min。④加4倍痰量磷酸鹽緩沖液（PBS）后繼續水浴5 min。⑤將稀化的痰液經48μm尼龍膜過濾后，離心機2000r/min離心

10 min，收集上清液，置入-70℃冰箱冷凍保存待測；細胞成分重懸于PBS中，涂片2張，編號。

1.2.3痰液染色（HE染色）將涂片自然干燥后置于二甲苯內2 min。再移至無水酒精內2 min，取出排液后移至90%酒精內1 min。再移至蘇木素染液內靜置30 min，然后置入沖洗盆內沖洗10 min，使粉紅色變為藍色。涂片在鹽酸酒精內浸漬伴搖動數秒，再次沖洗使涂片再次變藍。將涂片移到1%伊紅液內2 min，對比染色，再沖洗涂片3 min，分化伊紅。取出排液后移到90%酒精內搖振15 s，再移至無水酒精Ⅰ內搖振15 s，再移至無水酒精Ⅱ內搖振30 s。涂片移至二甲苯Ⅰ內15 s，再移至二甲苯Ⅱ內15 s，取出后封固。

1.2.4痰液分類計數由不知道患者病情的病理醫師在高倍顯微鏡下計數400個有核細胞包括嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞，并計算各自百分比率，分別用Eos%、Neu%、Lym%、Mar%表示。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較前均進行正態檢驗和方差齊性檢驗，兩樣本均數比較依據方差齊性結果用t檢驗或t'檢驗，多個樣本均數比較用方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

痰液炎癥細胞分類計數測定結果（見表1、2）。

表1 喘息發作時各組炎癥細胞百分數比較（%，±s）

表1 喘息發作時各組炎癥細胞百分數比較（%，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.01；2）與對照組比較，P＞0.05；3）與哮喘組比較，P＞0.05

組別nEosNeuLymMar喘息Ⅰ組306.33±0.431）60.54±0.311）1.39±0.102）31.74±0.05喘息Ⅱa組309.38±0.411）60.58±0.341）1.38±0.102）28.66±0.02喘息Ⅱb組3015.45±0.281）3）60.62±0.391）1.40±0.112）22.53±0.01哮喘組3015.56±0.321）60.64±0.411）1.42±0.102）22.38±0.05對照組300.48±0.0438.34±0.251.44±0.0959.74±0.02

表2 喘息停止后各組炎癥細胞百分數比較（%±s）

表2 喘息停止后各組炎癥細胞百分數比較（%±s）

注：1）與對照組比較，P＞0.05；2）與對照組比較，P＞0.05；3）與哮喘組比較，P＜0.01

組別nEosNeuLymMar喘息Ⅰ組300.47±0.041）38.31±0.151）10.42±0.063）50.80±0.04喘息Ⅱa組306.24±0.0650.40±0.072）15.39±0.093）27.97±0.03喘息Ⅱb組哮喘組30 30 10.49±0.052）10.50±0.25 50.40±0.182）50.41±0.27 15.41±0.073）15.42±0.103）23.70±0.04 23.67±0.05對照組300.48±0.0438.34±0.251.44±0.0959.74±0.02 P值0.0010.0030.0020.004

2.1Eos比例

在喘息發作時，喘息各組明顯高于喘息停止后的喘息各組及對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），喘息Ⅰ組明顯低于喘息Ⅱ組，差異有統計學意義（t=-12.45，P＜0.01），喘息Ⅱa組低于喘息Ⅱb組，差異有統計學意義（t=-77.23，P＜0.01），喘息Ⅱb組與支氣管哮喘組比較，差異無統計學意義（t= -1.61，P＞0.05）；在喘息停止后，喘息Ⅰ組Eos比例迅速下降，與對照組比較，差異無統計學意義（t= -1.13，P＞0.05）,而喘息Ⅱb組Eos比例仍較高，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），與支氣管哮喘組比較，差異無統計學意義（t=-0.54，P＞0.05）。

2.2Neu比例

在喘息發作時，喘息各組明顯高于喘息停止期后的喘息各組及對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；在喘息停止后，喘息Ⅰ組與對照組比較，差異無統計學意義（t=-0.55，P＞0.05），喘息Ⅱ組Neu比例仍較高，其與對照組比較，差異有統計學意義

（P＜0.01），與支氣管哮喘組比較，差異無統計學意義（t=-1.12，P＞0.05），而喘息Ⅱa組與喘息Ⅱb組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3Lym比例

在喘息發作時，喘息各組與對照組比較差異無統計學意義（F=1.85，P＞0.05）；在喘息停止后，喘息各組均較喘息發作時的喘息各組和對照組高，差異有統計學意義（P＜0.01），喘息Ⅱ組Lym比例高于喘息Ⅰ組（P＜0.01），與支氣管哮喘組比較，差異無統計學意義（t=-1.09，P＞0.05）。

3 討論

誘導痰是以高滲鹽水霧化吸入誘導無痰或少痰受檢者產生足量痰液，以對下氣道分泌物中的細胞及其他液相成分進行分析研究的一種無創的檢測方法。作為一種直接的非侵入性定量定性檢測氣道炎癥的方法[5]，誘導痰安全、可靠[6-7]、簡便且患者易于接受，其具體優點表現如下：①標本來源豐富，易濃縮和重復，且安全性高；②可提供與支氣管肺泡灌洗液相似的氣道炎癥的定量信息；③可直接檢出與炎癥反應相關的炎癥細胞、炎癥介質和細胞因子；④誘導痰液來源于外周氣道至中央氣道比來源于肺段氣道和肺泡的分泌物，更能反映氣道分泌物的自然狀態。本實驗采用霧化吸入3%高滲鹽水后誘導痰，在嚴格的觀察下研究對象都能耐受檢查且痰處理、細胞分類計數均操作順利，結果較滿意，無一例出現氣促、發紺等病情加重而出現實驗中斷，這表明誘導痰確實為一種研究氣道炎癥的較理想的方法。因痰液細胞成分可進行細胞分類、免疫組織化學和分子生物學等檢查；液相成分可用于分子成分的測定[8]，因此可利用反復喘息患兒的痰液，通過其細胞成分來研究氣道炎癥發生的可能機制。

GERENG等[9]發現，哮喘患者誘導痰中嗜酸粒細胞的形態和功能與血液檢測結果一致，嗜酸粒細胞是臨床反映氣道炎癥的重要標志。本研究結果顯示，在喘息發作時，喘息各組Eos比例明顯高于喘息停止后的喘息各組及對照組（P＜0.01），說明嗜酸粒細胞參與喘息性支氣管炎和哮喘的發病，與LOUIS等[10]的研究結果一致；喘息Ⅰ組明顯低于喘息Ⅱ組和支氣管哮喘組（P＜0.01），喘息Ⅱa組低于喘息Ⅱb組（P＜0.01），而喘息Ⅱb組與支氣管哮喘組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），可見Eos比例具有隨病情進展和喘息發作次數的增加而增加的趨勢，發作頻率越高，這一趨勢越明顯，這可能是由于支氣管哮喘是一種特殊類型的慢性氣道炎癥性疾病，他有一個發生、發展的過程，在未給予抗哮喘（或抗嗜酸性粒細胞性氣道炎癥）治療前或未進行正規系統的治療，其呼吸道可能會表現出持續存在并緩慢進展的炎癥改變，從而導致痰液嗜酸粒細胞不斷隨病情進展和發作次數的增加而逐漸增加。在喘息停止后，喘息Ⅰ組Eos比例迅速下降，與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），而喘息Ⅱb組Eos比例仍較高，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），與支氣管哮喘組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示喘息停止后氣道炎癥和氣道高反應仍可以長期存在。因此，本研究為哮喘病長期規范治療的必要性提供一定的理論基礎，即哮喘病診斷一旦成立，不論輕重，都應該進行及時持續地抗炎治療。同時，本研究也提示，未明確診斷哮喘者，若喘息發作次數較多，尤其是發作持續時間較長者，也應堅持抗炎治療。

嗜酸性粒細胞浸潤性炎癥作為哮喘的基本特征已為人們所接受。從最新的GINA方案對哮喘的定義可以看出，人們對哮喘發病機制與病理生理的認識不再局限在嗜酸性細胞浸潤為主要特征的氣道炎癥性疾病，而是強調多種細胞參與的氣道慢性炎癥。隨著誘導痰技術的發展及其進一步在臨床的推廣應用，發現哮喘可能存在以其他炎癥細胞為主的呼吸道炎癥[11-14]。基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）可使T淋巴細胞浸潤到氣管，而淋巴細胞被認為在形成呼吸道高反應性的過程中起了重要作用。本研究結果顯示，在喘息停止后，喘息各組Lym比例較喘息發作時喘息各組和對照組高（P＜0.01），與SHIOTA等[15]的文獻報道一致，尤其喘息Ⅱ組Lym比例較高，與支氣管哮喘組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示淋巴細胞可能在維持哮喘慢性炎癥中發揮作用；而無論喘息患兒在喘息發作時還是在喘息停止后的痰液中，Mar比例均減少，是因為采用構成比，痰液其他細胞的增多必然使巨噬細胞相對減少，但是否存在其他機制尚需進一步研究。近年來國外有研究[16]表明，中性粒細胞浸潤性炎癥也是哮喘氣道炎癥中一種重要類型，使人們對中性粒細胞的致病作用愈發重視。在重癥哮喘和哮喘急性發作時，中性粒細胞的作用甚至已超過傳統意義的嗜酸性粒細胞[17-18]。DOUWES等[19]分析文獻發現，中性粒細胞性哮喘在輕、中度哮喘中也較普遍。雖然對于中性粒細胞在哮喘氣道炎癥中的作用和地位尚未完全明確，但對于

其在喘息發病過程中的作用，較為統一的認識是其合成并釋放的彈性蛋白酶為促進氣道黏液腺分泌的主要刺激物之一[20]。活化的中性粒細胞能夠通過釋放炎癥介質造成組織炎癥損傷，且其介質能增加支氣管組織對刺激的反應性。本研究結果顯示，在喘息發作時，喘息各組明顯高于喘息停止后的喘息各組及對照組（P＜0.01），說明中性粒細胞為急性氣道炎癥的主要效應細胞之一，進一步證實喘息發作時氣道炎癥的多樣性。在喘息停止后，喘息Ⅰ組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），喘息Ⅱ組其Neu比例仍較高，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01），而與支氣管哮喘組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示反復發作的喘息性支氣管炎和支氣管哮喘之間或許存在部分相同的發病機制，可能與中性粒細胞有一定的密切關系。或是與本組病例在喘息發作停止后3～5 d，與發作期的間隔時間較短，作為急性氣道炎癥的主要效應細胞之一的中性粒細胞尚未完全凋亡有關。

由于兒童哮喘在發病機制與病理生理上與成人哮喘存在差異，何種細胞在兒童哮喘中扮演最重要的角色尚無定論。如能針對不同的表型采取針對性的措施可能會取得更好的療效。因此檢測痰液細胞計數顯得尤為重要。

[1]Subcommittee on Diagnosis and Management of Bronchiolitis.Diagnosis and Management of Bronchiolitis[J].American Academy of Pediatrics,2006,118(4):1774-1793.

[2]中華醫學會兒科學分會呼吸學組.兒童支氣管哮喘防治常規[J].中華兒科雜志,2008,46(10):745-753.

[3]EFTHIMIADIS A,SPANEVELLO A,HAMID Q,et al.Methods of sputum processing for cell counts,immunocytochemistry and in situhybridization[J].Eur Respir J,2002,37(Suppl):19-23.

[4]PIZZICHINI E,PIZZICHINI MMM,EFTHIMIADIS A,et al.Indices of airway inflammation in induced sputum:reproducibility and validity of cell and fluidphase measurements[J].Am J Respir Crit Care Med,1996,154(2):308.

[5]LOUIS R,POTMANS V.Analysis of induced sputum in refractory asthma[J].Presse Med,2008,37(1 Pt 2):155-159.

[6]SPAHN JD.Asthma Biomarkers in sputum[J].Immunol Allergy Clin North Am,2012,32(3):387-399.

[7]BAKAKOS P,SCHLEICH F,ALCHANATIS M,et al.Induced sputum asthma:from bench to bedside[J].Curr Med Chem,2011, 18(10):1415-1422.

[8]DE NIJS S B,FENS N,LUTTER R,et al.Airway inflammation and mannitol challenge test in COPD[J].Respiratory Research, 2011,12(1):11.

[9]GERENG EA,SUKHODOLO IV,PLESHKO RI,et al.Comparative study of eosinophils in the blood and induced sputum during bronchial asthma[J].Bull Exp Biol Med,2004,137(1):50-52.

[10]LOUIS R,LAU LC,BRON AO,et al.The relationship between airways inflammation and asthma severity[J].Am J Respir Crit Care Med,2000,161(1):9-16.

[11]CHOON-SIK PARK,TAIYOUN RHIM.Application of proteomics in asthma research[J].Expert Review Proteomics,2011, 8(2):221.

[12]MOORE WC,MEYERS DA,WENZEL SE,et al.Identification of asthma phenotypes using cluster analysis in the severe asthma research program[J].Am J Respir Crit Care Med,2010,181 (4):315-323.

[13]SIROUX V,BASAGA?A X,BOUDIER A,et al.Identifying adult asthma phenotypes using a clustering approach[J].Eur Respir J,2011,38(2):310-317.

[14]LOTVALL J,AKDIS CA,BACHARIER LB,et al.Asthma endotypes:a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome[J].Jallergy Clin Immunol,2011, 127(2):355-360.

[15]SHIOTA Y,MATSUMOTO H,HIYAMA J,et al.Flow cytometric analysis of lymphocytes and lymphocyte subpopulations in induced sputum from patients with asthma[J].Int Allergology, 2000,49(2):125-133.

[16]GIBSON PG,SIMPSON JL,SALTOS N.Heterogeneity of airway inflammation in persistent asthma:evidence of neutrophilic inflammation and increased sputum interleukin-8[J].Chest,2001, 119(5):1329.

[17]JAMES AL,ELLIOT JG,ABRAMSON MJ,et al.Time to death, airway wall inflammation and remodelling in fatal asthma[J].Eur Respir J,2005,26(3):429-434.

[18]JUNG JW,KIM S H,KWON JW,et al.Clinical characteristics and long-term outcomes related to sputum eosinophilia in Kerean asthmatics[J].Asia Pac Allergy,2011,1(1):16-24.

[19]DOUWES J,GIBSON P,PEKKANEN J,et al.Non-eosinophilic asthma:importance and possible mechanisms[J].Thorax,2002,57 (7):643-648.

[20]VIGNOLA AM,BONANNO A,MIRABELLA A,et al.Increased level of elatase and alphal-antitrysin in sputum of asthaatic patients[J].Am J Respir Crit Care Med,1998,157(2):505-511.

（張蕾 編輯）

Clinical significance of inflammatory cells in induced sputum of wheezy children

Li-li DENG1,Xiao HE2,Ye-fei LEI1,Kang-jie LI2,Qi-liang XIAO3
(1.Department of Paediatrics,Children's Hospital Affiliated to the First People's Hospital of Chenzhou,Chenzhou,Hunan 423000,P.R.China;2.Department of Orthopedics,the First People's Hospital of Chenzhou,Chenzhou,Hunan 423000,P.R.China;3.Department of Paediatrics,the Second Affiliated Hospital,South China University, Hengyang,Hunan 421001,P.R.China)

【Objective】To explore the ratios of inflammatory cells in induced sputum of wheezy children and analyze the significance.【Methods】Thirty cases with asthma and ninety cases with asthmatic bronchitis were enrolled into this study.The patients with asthmatic bronchitis were randomly divided into wheezingⅠgroup and wheezingⅡgroup according to the frequency of wheezing attack,while the later was subdivided into wheezingⅡa group and wheezingⅡb group according to the duration of wheezing attack from the first time to the last time.There were thirty cases in each of the three groups which were enrolled as observed groups. In the same period of time,thirty healthy volunteers were into control group.Inflammatory cells such as neutrophils,eosinophils and lymphocytes were detected by means of induced sputum in all the above groups.

asthma;asthmatic bronchitis;induced sputum;inflammatory cell

R725.6

B

1005-8982（2015）24-0061-05

2015-02-16

【Results】Eosinophil cell ratio:The ratio at wheezing attack in each wheezing group was higher than that in the control group and each wheezing group after wheezing attack(P＜0.01).The eosinophil ratio of the wheezingⅠgroup was much lower than that of the wheezingⅡgroup(P＜0.01),and the wheezingⅡa group had a lower proportion than the wheezingⅡb group(P＜0.01).There was no significant difference between the wheezingⅡb group and the asthma group(P＞0.05).When wheezing stopped,the eosinophil ratio of the wheezingⅠgroup was markedly decreased and had no significant difference from that in the control group(P＞0.05).Meanwhile,the ratio of the wheezingⅡb group kept high and had a significant difference from that of the control group(P＜0.01)but no statistical difference from that of the asthma group(P＞0.05).Neutrophil cell ratio:The ratios of the wheezing groups at wheezing attack were much higher than those of the control group and the wheezing groups after wheezing attack and the differences were significant(P＜0.01).After wheezing attack,there was no obvious difference between the wheezingⅠgroup and the control group(P＞0.05)while the ratio of the wheezingⅡgroup remained high with a significant difference from that of the control group(P＜0.01),but without a significant difference from that of the asthma group(P＞0.05).The difference between the wheezingⅡa group and the wheezingⅡb group was not significant(P＞0.05).Lymphocyte cell ratio:At wheezing attack no evident differences were found between all the wheezing groups and the control group(P＞0.05).On the contrary,when wheezing stopped,each wheezing group had a significantly higher neutrtophil proportion than the control group and each wheezing group at wheezing attack(P＜0.01).The wheezingⅡgroup had a higher proportion than the wheezingⅠgroup(P＜0.01)while had no significant difference with the asthma group(P＞0.05).【Conlusions】Combined with to clinical history,dynamic observations on the ratios of inflammatory cells may be of some value in the early diagnosis and treatment of asthmatic bronchitis which may develop into bronchial asthma.